论文摘要
1目的1.1探讨缺氧（hypoxia）对人肺微血管内皮细胞（HPMVECs）肌动蛋白细胞骨架（F-actin）重构的影响,以及Rho-ROCK信号通路在缺氧引起肌动蛋白细胞骨架重构过程中的作用。1.2研究缺氧条件下,HPMVECs内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性的变化规律和重组人白介素10（rhIL-10）对缺氧HPMVECs凋亡的影响。2方法2.1在缺氧前用ROCK的特异性抑制剂H-1152,最佳浓度（10 nmol/L）对体外培养的HPMVECs进行预处理0.5h,再分为不同缺氧时间组进行缺氧6h、12h及24h处理,并设常规培养正常对照组,每组设8个复孔。用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察缺氧或使用H-1152对HPMVECs细胞肌动蛋白细胞骨架重构的影响。流式细胞技术检测各组HPMVECs F-actin的平均荧光强度的变化,行统计学分析。2.2常规培养HPMVECs细胞株,分为5组:正常对照组（常规培养）;缺氧（5% CO2,95% N2）对照组;缺氧培养并加入rhIL-10以（10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL）的浓度分别干预的rhIL-10低剂量干预组、rhIL-10中剂量干预组、rhIL-10高剂量干预组。培养4h、12h、24h、48h离心收集细胞,荧光显微镜观察HPMVECs 24h核荧光染色,分析荧光强度,化学比色法检测细胞核内Caspase-3活性检测,行统计学分析。3结果3.1 HPMVECs 6h各组, LSCM观察显示F-actin细胞骨架未发生明显改变,流式细胞术行F-actin荧光强度分析与正常对照组比较差别无统计学意义（P>0.05）。缺氧12h组,用LSCM观察到F-actin细胞骨架已发生少量解聚,运用流式细胞术行F-actin荧光强度分析,提示F-actin含量增加与正常对照组比较差别有统计学意义（P<0.05）;而H-1152+缺氧12h组,细胞骨架及细胞周边的肌动蛋白丝带无明显变化,胞浆中仅有极少量模糊的肌动蛋白,流式细胞术行F-actin荧光强度分析提示F-actin含量与缺氧组比较差别有统计学意义（P<0.05）。缺氧24h组,用LSCM观察到F-actin细胞骨架已发生大量解聚,细胞骨架明显改变,流式细胞术行F-actin荧光强度分析提示F-actin含量与正常对照组比较差别有统计学意义（P<0.05）; H-1152+缺氧24h,细胞骨架及细胞周边的肌动蛋白丝带有少量变化,胞浆中有模糊的肌动蛋白出现,流式细胞术行F-actin荧光强度分析提示F-actin含量与正常对照组比较及缺氧组比较差别均存在统计学意义（P<0.05）。H-1152各时间组在用LSCM观察F-actin细胞骨架与正常对照组比较无明显差异,流式细胞术行F-actin荧光强度分析提示F-actin含量与正常对照组比较差别无统计学意义（P>0.05）。HPMVECs经缺氧处理,肌动蛋白细胞骨架发生解聚,应力纤维的排列和分布改变;事先使用H-1152再进行缺氧处理,可防止缺氧所致HPMVECs内F-actin解聚及其含量增加,同时应力纤维在细胞内排列和分布趋向正常。3.2取24h各组行凋亡细胞核Hoechst荧光染色,灰度值分析低氧对照组和低、中、高rhIL-10干预组与正常对照组比较升高（P<0.05）;低、中、高rhIL-10干预组与缺氧对照组比较降低（P<0.05）。凋亡蛋白Caspase-3相对活性,4h各组别无明显差异（P>0.05）;12h缺氧对照组、低、中rhIL-10干预组与正常组比较升高（P<0.05）,高剂量rhIL-10干预组与正常对照组无明显差异（P>0.05）,rhIL-10干预各组与缺氧对照组比较降低（P<0.05）;24h缺氧对照组、rhIL-10干预低、中、高剂量组与正常对照组比较升高（P<0.05）,低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较明显降低（P<0.05）;48h缺氧对照组与低剂量rhIL-10干预组与正常对照组比较升高（P<0.05）,其余各组别无明显差异（P>0.05）;缺氧凋亡峰值见于24h。4结论4.1缺氧所致HPMVECs内的F-actin重构改变。4.2 Rho-ROCK信号通路参与缺氧所致HPMVECs内F-actin细胞骨架的重构改变。4.3缺氧可促进HPMVECs凋亡,缺氧条件下,Caspase-3在HPMVECs的表达明显升高。4.4 rhIL-10可一定程度地抑制缺氧HPMVECs的凋亡。
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