ASACC基因转化‘新红星’苹果的研究

论文摘要

本研究以苹果品种‘新红星’（‘starkrimson’）为试材，建立了其高效再生体系，为‘新红星’苹果遗传转化研究打下基础。采用农杆菌介导法将ASACC基因转入‘新红星’苹果中，以期获得含有ASACC基因的、耐贮藏的‘新红星’苹果新种质。研究结果如下：1．研究了基本培养基类型、激素种类和浓度、外植体类型、暗处理时间以及叶片放置方式对‘新红星’苹果再生频率的影响，结果表明：三种外植体的最适基本培养基均为MS培养基；TDZ的诱导效果强于6-BA，最佳浓度配比为MS+TDZ 1.0 mg／L+NAA 0.3mg／L+蔗糖30 g／L+琼脂6.0g／L；叶片的再生效果最好，其次为白化茎段，茎段最差，叶片和茎段的最佳暗处理时间为3周，白化茎段的最佳暗处理时间为2周。叶片放置方式对‘新红星’苹果再生频率影响不大。2．应用农杆菌介导法，以‘新红星’苹果的叶片为受体材料，进行了不同选择压、农杆菌侵染时间、共培养时间、抑菌素种类和浓度等遗传转化影响因素的研究，建立的‘新红星’苹果遗传转化体系为：叶片经农杆菌侵染4 min、在含TDZ1.0 mg／L，NAA0.3 mg／L的MS培养基上黑暗共培养3 d、添加250 mg／LCef，能获得最佳的GUS基因瞬时表达率为35.6％。最佳的选择压为Kin12.5mg／L3．在利用农杆菌介导法的基础上，采用SAAT法，对‘新红星’苹果遗传转化体系进行了优化，以期提高转化效率。利用GUS基因瞬时表达的方法研究了共培养时间、超声波处理功率、处理时间、及农杆菌悬浮液中乙酰丁香酮（AS）浓度对苹果基因转化效率的影响。结果表明：叶盘在OD600为0.6时且含有75mg／LAs的农杆菌悬浮液中侵染4 min，在此期间，用功率为80 w的超声波处理40 s，然后放到‘新红星’苹果的再生培养基上共培养3 d，获得最佳的GUS基因瞬时表达率为75.6％。4．利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法对‘新红星’苹果的km抗性植株进行检测，结果初步表明，ASACC基因已经整合进其中的7个株系的基因组中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 苹果遗传转化研究进展
• 1.1 影响苹果离体再生系统的因素
• 1.1.1 基因型
• 1.1.2 外植体
• 1.1.2.1 叶片的来源
• 1.1.2.2 叶片的发育程度
• 1.1.2.3 叶片不同部位
• 1.1.2.4 叶片放置方式
• 1.1.2.5 叶片的处理方式
• 1.1.3 培养基类型及激素种类和浓度
• 1.1.4 前期暗处理
• 1.1.5 抗生素
• 1.1.6 其他
• 1.1.6.1 碳源
• 1.1.6.2 固化物
• 3'>1.1.6.3 AgNO₃
• 1.2 影响农杆菌介导遗传转化系统的影响因素
• 1.2.1 农杆菌菌株
• 1.2.2 菌液侵染条件
• 1.2.3 共培养条件
• 1.2.4 酚类物质活化Vir区
• 1.2.5 抗生素及转化植株选择策略
• 2 RNA干扰研究进展
• 2.1 RNAi的发现
• 2.2 RNAi的作用机制
• 2.3 RNAi的特点
• 2.3.1 高度特异性
• 2.3.2 高效性
• 2.3.3 其他
• 2.3.3.1 种属实效性
• 2.3.3.2 dsRNA的长度限制性
• 2.3.3.3 RNAi的遗传性
• 2.3.3.4 传播性
• 2.3.3.5 ATP依赖性
• 2.4 RNAi在植物中的应用
• 2.4.1 植物中RNAi诱导方法
• 2.4.2 RNAi在植物功能基因组研究中的应用
• 2.5 RNAi在果树上的应用
• 2.6 RNAi与反义RNA的比较
• 3 乙烯调控果实成熟研究进展
• 3.1 果实成熟中乙烯的合成及生理作用
• 3.2 调控乙烯合成的基因工程
• 3.2.1 ACC合成酶（ACS）基因
• 3.2.2 ACC氧化酶（ACO）基因
• 4 超声波法在植物转基因中的应用
• 4.1 超声波法的原理
• 4.2 超声波直接转导法在植物转化中的应用
• 4.3 SAAT法在植物转化中的应用
• 5 小结
• 参考文献
• 第二章 ‘新红星’苹果再生体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 再生体系的建立
• 1.2.1.1 接种培养
• 1.2.1.2 基本培养基的筛选
• 1.2.1.3 激素种类及浓度组合对‘新红星’苹果外植体再生的影响
• 1.2.1.4 暗培养时间对‘新红星’苹果外植体再生的影响
• 1.2.1.5 叶片不同放置方式对再生的影响
• 1.3 结果调查与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同基本培养基对‘新红星’外植体再生率的影响
• 2.2 激素种类及浓度组合对‘新红星’外植体再生的影响
• 2.2.1 BA和NAA浓度组合对‘新红星’外植体再生的影响
• 2.2.2 TDZ和NAA浓度组合对‘新红星’外植体再生的影响
• 2.3 暗培养时间对‘新红星’外植体再生的影响
• 2.4 叶片放置方式对再生的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 农杆菌介导‘新红星’苹果遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株、质粒及基因性质
• 1.1.3 菌株的保存
• 1.1.4 细菌培养基与培养液
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养、活化
• 1.2.2 卡那霉素选择压的确定
• 1.2.2.1 卡那霉素浓度对‘新红星’试管苗繁殖的影响
• 1.2.2.2 卡那霉素浓度对‘新红星’苹果叶片再生的影响
• 1.2.3 农杆菌侵染时间的确定
• 1.2.4 共培养时间对叶片转化再生的影响
• 1.2.5 头孢霉素浓度的确定
• 1.2.5.1 头孢霉素对‘新红星’苹果试管苗生长的影响
• 1.2.5.2 头孢霉素对‘新红星’苹果叶片转化的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 Km选择压的确定
• 2.2 农杆菌侵染时间的确定
• 2.3 共培养时间对转化再生的影响
• 2.4 头孢霉素浓度的确定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 超声波辅助农杆菌介导‘新红星’苹果遗传转化体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株、质粒及基因性质
• 1.1.3 菌株的保存
• 1.1.4 细菌培养基与培养液
• 1.2 方法
• 1.2.1 根癌农杆菌的培养
• 1.2.2 转化方法
• 1.2.3 共培养
• 1.2.4 GUS基因瞬时表达的检测
• 1.2.5 结果调查与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 共培养时间对GUS基因瞬时表达的影响
• 2.2 超声波处理功率和时间对GUS基因瞬时表达的影响
• 2.3 不同AS浓度对GUS基因瞬时表达的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 ASACC基因转化‘新红星’苹果转基因植株的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株的性质
• 1.1.3 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 GUS组织化学染色
• 1.2.2 PCR扩增检测
• 1.2.2.1 DNA提取与纯化
• 1.2.2.2 阳性质粒的提取
• 1.2.2.3 PCR扩增
• 1.2.2.4 电泳检测
• 2 结果分析
• 2.1 GUS组织化学检测
• 2.2 PCR扩增检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 图版
• 致谢