论文摘要
辐射抗性微生物是一种重要的极端微生物资源,其对环境的适应性生长是微生物与外界环境相互作用的结果。耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）是目前所知的最抗辐射的生物之一,具有超强的辐射抗性和完善的DNA修复机制。关于辐射抗性微生物的起源与进化,人们虽然提出了各种假说,但都缺乏相应的实验证据,其起源与进化机制至今仍然是一个谜。本文研究主要以非辐射抗性菌株大肠杆菌（Escherichia coli）K-12为材料,通过83次γ射线辐射进化诱导,筛选得到具有一定辐射抗性能力的突变菌株,然后通过基因组序列比较、差异蛋白质组、部分基因的转录水平和蛋白质氧化损伤等方面的分析,研究大肠杆菌在电离辐射压力下的适应性进化机制。同时分析了耐辐射球菌（D.radiodurans）在γ射线辐射前后的细胞内外蛋白质组表达水平差异,探讨耐辐射球菌超强的辐射抗性与DNA损伤修复机理。1.首先以大肠杆菌（E.coli）K-12为起始菌株,在反复多次的γ射线电离辐射后筛选得到具有一定辐射抗性能力的细菌。对菌株IR58、IR21和IR51进行逆境生存率分析,结果表明IR58、IR21和IR51对γ射线辐射抗性能力增强,同时IR58和IR21对紫外线UV和丝裂霉素C也产生了一定的抗性。2.选取具有较强辐射抗性能力的菌株IR58和IR21,通过Solexa GenomeAnazyler系统进行基因组测序。将IR58和IR21的基因组序列与大肠杆菌K-12的标准基因组序列比较后发现,IR58和IR21基因组在辐射损伤的适应性进化过程中经历了大量的基因突变与DNA片段复制事件。在IR58和IR21中找到了正在进行的基因复制现象,这些基因在核苷酸水平上有很高的相似度,同时也找到了经过插入突变与删除等的“去功能化”作用后分化较厉害的序列。在IR58和IR21中有大量分散存在于基因组的SNP位点,来源于受外界环境损伤后基因序列内的单碱基置换。进一步分析发现在IR58菌株中,uvrB,mutM、lexA、hepA、danX等5个DNA修复和复制相关基因发生了碱基替换和插入删除突变,而在IR21菌株中,recC、recJ,dnaE,mutM、hepA和mutS等6个基因也发生了碱基替换和插入删除等突变。基因组比对的结果表明,IR58和IR21两个菌株发生了大量的点突变、基因分子复制重排和DNA片段的缺失等事件。3.利用二维液相色谱分离系统结合质谱鉴定方法分析了大肠杆菌K-12和IR58、IR21在γ射线诱导下蛋白质组表达水平差异。与K-12相比,有144个蛋白质在IR58和IR21中表达水平升高或降低的变化趋势是一致的,通过质谱分析后成功鉴定了39个蛋白。而有38个蛋白的变化趋势是不同的,通过质谱分析后成功鉴定15个蛋白。鉴定得到的这些蛋白归属于不同的生物学功能,其中有4个变化趋势相同的蛋白曾被报道与DNA修复机制相关。4.分析了辐射抗性菌株IR58和IR21中部分DNA修复相关基因的转录水平,发现参与切除修复途径的基因特别是uvrABC基因的转录水平都有不同程度的提高,参与同源重组途径的recA,ssb,recBCD和recFOR等相关基因的转录水平也有提高。同时使用DNPH法分析了细胞内蛋白质的氧化损伤程度,发现IR58和IR21在受到γ射线损伤后,氧化损伤的程度比野生株K-12要低,说明IR58和IR21细胞内保护蛋白质免受氧化损伤的能力提高了。5.为了研究耐辐射球菌的辐射抗性和DNA修复相关机制,应用蛋白质组学的分离和鉴定方法考察了耐辐射球菌胞内蛋白和胞外分泌蛋白在γ射线辐照诱导下表达水平差异。其中,胞内有26个蛋白质的表达水平有明显的增加,胞外有29个蛋白质发生了明显的表达水平变化。通过生物质谱鉴定得到部分蛋白质的信息,发现这些蛋白质在细胞中分别归属于不同的生物学功能,而且大部分蛋白质未曾报道与辐射抗性机制相关。对细胞内总蛋白表达谱分析发现有两个蛋白（SSB、PprA）曾报道与DNA修复相关,而有5个蛋白的功能是参与细胞的调控与信号转导。对胞外蛋白的鉴定与分析发现,有1个蛋白曾报道与DNA修复相关,有8个蛋白与细胞物质的转运和分泌相关。