单纯疱疹病毒性脑炎发病机制及靶向MMP-9基因治疗的研究

论文摘要

第一部分单纯疱疹病毒性脑炎相关病理机制的研究实验一MMP-9在单纯疱疹病毒性脑炎中的表达及对血脑屏障的影响目的：研究单纯疱疹病毒感染小鼠脑组织后MMP-9的变化及对血脑屏障通透性的影响。方法：小鼠颅内注射单纯疱疹病毒1型（HSV-1）制造单纯疱疹病毒性脑炎模型，于感染后第3天、7天，应用明胶酶谱分析检测脑组织中MMP-9活性，免疫荧光检测MMP-9的细胞来源，通过检测渗出到脑血管外的伊文斯蓝（Evans Blue，EB）的含量以及脑组织水含量观察血脑屏障的通透性。结果：HSV-1感染后第3天、7天病毒组中MMP-9活性较正常对照组明显增高，MMP-9活性增高与血脑屏障通透性增高相一致，给予MMP-9抑制剂BB-94后血脑屏障通透性降低，激活的小胶质细胞是MMP-9的主要来源。结论：激活的小胶质细胞表达MMP-9破坏血脑屏障，在单纯疱疹病毒性脑炎的发病机制中起着重要作用。实验二糖皮质激素对单纯疱疹病毒性脑炎的作用目的：探讨小胶质细胞在单纯疱疹病毒性脑炎中的激活以及不同时间点糖皮质激素联合抗病毒药物治疗对单纯疱疹病毒性脑炎的影响。方法：小鼠随机分为对照组、HSV-1感染组（感染组）、阿昔洛韦治疗组（阿昔洛韦组）、阿昔洛韦治疗加地塞米松早期干预组（早期干预组）和阿昔洛韦治疗加地塞米松延迟干预组（延迟干预组）5组。采用流式细胞术测定脑组织小胶质细胞表面抗原CD11b，并用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测促炎性细胞因子TNF-α、IL-6表达，通过脑组织病理切片观察组织形态学变化。病毒感染后第5天对小鼠进行神经功能评分，2周后应用Kaplan-Meier法对各组小鼠进行生存率分析。结果：病毒感染后第7天，与对照组比较，感染组脑组织CD11b阳性细胞及促炎性细胞因子明显增多（P＜0．01），小胶质细胞激活，早期干预组可见小胶质细胞明显激活伴大量促炎性细胞因子产生（P＜0．05）：与感染组比较，阿昔洛韦组和延迟干预组小胶质细胞激活减少（P＜0．01），促炎性细胞因子降至正常水平。延迟干预组与阿昔洛韦组相比小胶质细胞激活减少（P＜0．01），促炎性细胞因子表达及生存率无显著差异（P＞0．05）；与早期干预组比较，延迟干预组CD11b及促炎性细胞因子表达均明显减少（P＜0．01），小鼠脑组织病理改变减轻，神经功能评分与生存率均明显提高（P＜0．05）。结论：在抗病毒治疗基础上，延迟给予糖皮质激素治疗可改善单纯疱疹病毒性脑炎预后。第二部分HSV-1感染小胶质细胞后MMP-9及炎性因子分泌特点研究目的：研究单纯疱疹病毒（HSV-1）感染小胶质细胞系BV2后炎性因子的表达特点，探讨BV2细胞可否作为小鼠单纯疱疹病毒性脑炎模型的替代研究对象。方法：小鼠颅内注射HSV-1制造小鼠单纯疱疹病毒性脑炎（herpes simplexencephalitis，HSE）模型，小胶质细胞系BV2细胞接种HSV-1制造细胞模型，MTT法选择合适的细胞用药浓度，RT-PCR法检查MMP-9及炎性因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、iNOS）mRNA含量，比较两种模型接种病毒前后以及用药前后细胞因子表达的变化。结果：BV2细胞与动物模型小鼠在病毒感染及相关药物作用前后，MMP-9及炎性因子具有一致的变化趋势。结论：BV2细胞和Balb/c小鼠脑组织具有相似的免疫反应特性，可作为小鼠单纯疱疹病毒性脑炎模型的替代研究对象。第三部分NADPH氧化酶对HSV-1感染的小胶质细胞MMP-9激活的影响目的：探讨单纯疱疹病毒1型（HSV-1）诱导小鼠源性小胶质细胞（BV2）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的相关机制以及NADPH氧化酶在其中的作用。方法：使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HSV-1感染后NADPH氧化酶亚基p47phox的变化，处理组给予不同浓度NADPH氧化酶特异性抑制剂Apocynin（0．5 mmol/L，1．0 mmol/L）干预后，用Dihydroethidium（DHE）测定细胞内ROS的产生量以及用明胶酶谱法分析检测细胞培养上清中MMP-9活性。结果：HSV-1作用小胶质细胞后，p47phox和MMP-9基因表达较正常对照组表达明显增高（P＜0．01），细胞内ROS水平增高约两倍以上，给予Apocynin后细胞内ROS水平与MMP-9的表达及活性均下降。结论：NADPH氧化酶在HSV-1激活小胶质细胞MMP-9表达中起着关键作用，可能通过ROS介导MMP-9激活。第四部分靶向MMP-9基因治疗单纯疱疹病毒性脑炎的实验研究目的：研究MMP-9-siRNA治疗单纯疱疹病毒性脑炎MMP-9的可行性，为其临床应用提供实验依据。方法：小鼠颅内注射单纯疱疹病毒1型（HSV-1）制造单纯疱疹病毒性脑炎模型，颅内局部注射MMP-9靶向的siRNA（MMP-9-siRNA），于第3天、7天应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印记分析检测脑组织中MMP-9表达，通过检测渗出到脑血管外的伊文斯蓝（Evans Blue，EB）的含量以及脑组织水含量观察血脑屏障的通透性，应用免疫组织化学方法检测水孔蛋白-4的表达，实时定量PCR检测细胞因子的表达，病毒感染后7天对小鼠进行神经功能评分。结果：转染MMP-9靶向的siRNA后第3天、7天，病毒感染脑组织中MMP-9表达较对照组降低，MMP-9表达降低与血脑屏障通透性下降相一致，血管周围水孔蛋白-4的表达减少，肿瘤坏死因子因子-α和白介素-6表达降低，小鼠神经功能改善。结论：MMP-9在单纯疱疹病毒性脑炎的发病机制中起着重要作用，MMP-9-siRNA治疗可减轻脑组织病理损害，改善脑炎预后。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 单纯疱疹病毒性脑炎相关病理机制的研究
• 实验一 MMP-9在单纯疱疹病毒性脑炎中的表达及对血脑屏障的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验二 糖皮质激素对单纯疱疹病毒性脑炎的作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 HSV-1感染小胶质细胞后MMP-9及炎性因子分泌特点研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 NADPH氧化酶对HSV-1感染的小胶质细胞MMP-9激活的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四部分 靶向MMP-9基因治疗单纯疱疹病毒性脑炎的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究总结
• 综述 基质金属蛋白酶在中枢神经系统疾病中的作用
• 参考文献
• 附录一 攻读学位期间发表论文目录
• 附录二 英文缩略词表
• 致谢