丹参酮IIA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231作用的实验研究

论文摘要

目的：乳腺癌在女性恶性肿瘤中最为常见，在其综合治疗中内分泌治疗是重要的组成部分，但内分泌治疗对雌激素受体阴性的乳腺癌几乎无效。探讨丹参酮ⅡA对人雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231体外增殖抑制作用及对细胞凋亡的影响，初步探索其作用机理，为丹参酮ⅡA应用于临床治疗雌激素受体阴性乳腺癌提供理论依据。方法：四甲基偶氮唑蓝（MTT法）法检测人乳腺癌细胞MDA-MB-231经不同药物浓度的丹参酮IIA处理后细胞的增殖情况，并计算细胞抑制率。用Excel软件绘制出细胞生长抑制曲线，并计算其半效抑制浓度（IC50）。丹参酮ⅡA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用采用克隆形成试验来检测。不同剂量的丹参酮ⅡA（0.0625、0.125、0.250、0.500μg/ml）处理细胞，对照组不处理，每个剂量组设置复孔4个，低倍显微镜观察克隆形成并计数各孔克隆数。倒置显微镜观察以0、0.0625、0.125、0.250、0.500、1.00μg/ml6个浓度的丹参酮ⅡA培养48h的细胞形态。ELISA法检测不同剂量的丹参酮ⅡA（0.0625、0.125、0.250μg/ml）处理组细胞及空白对照组细胞的无血清培养基中VEGF蛋白浓度。流式细胞仪（FCM）检测空白对照组和实验组细胞凋亡情况。其中实验组丹参酮ⅡA终浓度为0.0625、0.125、0.250、0.500μg/ml。每个组均设平行样本3个。按试剂盒操作说明书收集对照组和实验组的细胞进行固定、染色，通过FCM检测细胞凋亡，定量测定细胞凋亡率并进行细胞周期分析。二苯胺反应法测定空白对照组和实验组DNA片段化比率。结果：1、各实验组结果均表明丹参酮ⅡA对MDA-MB-231有显著抑制其增殖作用，且该抑制作用与浓度、时间呈正相关（P<0.05），半效抑制浓度（IC50）为0.125μg/ml。2、丹参酮ⅡA对肿瘤细胞克隆形成具有抑制作用，对照组MDA-MB-231细胞克隆形成数为236±11，用0.0625、0.125、0.250、0.500μg/ml丹参酮ⅡA处理后，克隆形成数分别为112±7、63±5、32±3、16±3，与空白对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），其抑制作用与药物浓度呈正相关。3、丹参酮ⅡA作用于MDA-MB-231细胞在倒置显微镜下显示肿瘤细胞形状不规则、细胞皱缩变小、细胞间隙增加、倾向于单个生长，悬浮细胞增多，肿瘤细胞的侵袭性减弱。随浓度的增大此形态变化更加明显。且在相同的显微镜视野下观察发现肿瘤细胞数也随丹参酮ⅡA药物浓度的增加呈现减少的趋势。4、用不同浓度丹参酮ⅡA处理48h后，MDA-MB-231细胞无血清培养基中的VEGF蛋白浓度显著降低，其抑制作用呈剂量-效应关系（P<0.05）。5、由流式细胞术检测的结果显示，实验组MDA-MB-23l细胞凋亡率随着药物浓度的增加呈逐渐升高趋势，且MDA-MB-23l细胞凋亡率与丹参酮ⅡA的药物浓度呈量效关系。不同浓度丹参酮ⅡA处理MDA-MB-231细胞48h后，细胞周期分布发生变化，与对照组比较，实验组G0/G1期细胞数目明显增多（P<0.05），而S期和G2/M期细胞数目明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，并呈剂量效应关系。乳腺癌MDA-MB-231细胞G1期峰前出现的亚二倍体凋亡峰可以经碘化丙啶（PI）染色后观察到。6、用不同浓度的丹参酮ⅡA作用MDA-MB-231细胞后，MDA-MB-231细胞DNA片段化比率明显增加，与空白对照组比较差异有显著性（P<0.05），且具有剂量依赖性（P<0.05）。结论：1、丹参酮ⅡA对人雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有明显的增殖抑制作用。2、丹参酮ⅡA对人雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有促进细胞凋亡作用。3、丹参酮ⅡA对人雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的VEGF表达有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验细胞
• 2.2 主要试剂及仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要试剂的配置
• 2.2.3 主要仪器与设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 细胞增殖抑制试验（MTT 法）
• 2.3.3 克隆形成实验
• 2.3.4 倒置显微镜下细胞形态的观察
• 2.3.5 VEGF 蛋白浓度的测定
• 2.3.6 流式细胞术检测
• 2.3.7 二苯胺反应法测定 DNA 片段化比率
• 2.4 统计学方法
• 第3章 结果
• 3.1 丹参酮ⅡA 对 MDA-MB-231 的生长抑制作用
• 3.2 丹参酮ⅡA 对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用
• 3.3 不同浓度丹参酮ⅡA 处理后的 MDA-MB-231 细胞形态
• 3.4 ELISA 法检测人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 VEGF 表达
• 3.5 丹参酮ⅡA 对乳腺癌细胞周期的影响
• 3.6 经不同浓度的丹参酮ⅡA 处理对肿瘤细胞 DNA 片段化比率的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 丹参酮ⅡA 对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖的抑制作用
• 4.2 丹参酮ⅡA 对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞凋亡的影响
• 4.3 乳腺癌生物学的特征及与 VEGF 的关系
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述（一）
• 参考文献
• 综述（二）
• 参考文献