论文摘要
目的:结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年增加的趋势,在我国部分地区已经超过直肠癌,从而明显改变了我国长期以来大肠癌中以直肠癌为主的格局。这种发病趋势与西方发达国家中结直肠癌的发病情况趋向一致。目前手术仍是治疗结肠癌最主要而有效的方法。但是5 年生存率一直未有明显提高。因此,如何改善预后、提高生存率是亟待解决的问题。随着分子生物学的发展,肿瘤的基因治疗取得了明显的进展,越来越多的基因治疗方案获准或正在进行临床试验。目前国际上已经有近千项基因治疗方案获准进入临床试验。抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中所发挥的特殊作用而使抑癌基因疗法成为肿瘤基因治疗的重要策略之一。新近发现的抑癌基因PTEN 基因在肿瘤发生、发展及其它许多方面发挥重要的作用。PTEN 基因在结肠癌,尤其是进展期结肠癌中的突变率较高,将其作为结肠癌基因治疗的靶基因可能具有重要的研究价值。为此,本课题构建携带PTEN 基因的重组腺病毒载体,体外转染PTEN基因缺失的LoVo 细胞株,观察PTEN 基因重组腺病毒对结肠癌细胞生物学行为的影响,以期为结肠癌的基因治疗提供新的途径。方法:第一部分:PTEN 基因重组腺病毒的构建。分别双酶切pBP-PTEN 质粒和pDC315 质粒,回收并纯化PTEN cDNA 片断和pDC315 质粒的大片断,使二者连接获得含有PTEN 基因的重组穿梭质粒载体,酶切鉴定及测序证实构建成功。采用位置特异性重组方法构建PTEN 基因重组腺病毒载体。用脂质体介导pDC315.PTEN 和pBHGloxΔE1,3Cre 共转染293 细胞产生PTEN 基因重组腺病毒,经293 细胞扩增,纯化制取高滴度重组腺病毒。以相同的方法扩增和纯化Ad.LacZ。第二部分:PTEN 基因重组腺病毒对LoVo 细胞生物学行为的影响。检测Ad.LacZ 对LoVo 细胞的转染效率以确定Ad.PTEN 的MOI,Western Blot 检测PTEN 基因的表达,MTT 法检测Ad.PTEN转染后LoVo 细胞生长的变化,双层软琼脂克隆形成实验检测其克隆形成率,流式细胞术技术检测转染后细胞周期及凋亡的变化,Borden 小室实验检测其侵袭运动能力的变化,Western Blot 检测转染前后LoVo 细胞nm23-H1 表达的变化。结果:①用位置特异性重组方法成功构建了携带人PTEN 基因的重组腺病毒载体（Ad.PTEN）,其滴度约5×1010pfu/ml;②确定Ad.PTEN 对LoVo 细胞的最佳感染复数
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