癫痫大鼠海马DG区增殖的内源性神经前体细胞的演变及基因工程细胞移植治疗癫痫大鼠的实验研究

论文摘要

癫痫是一组由多种病因引起的慢性脑功能障碍综合症，是大脑神经元异常放电所引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱。我国的癫痫发病率为1％。左右，而患病率为0.5％～1％，癫痫是影响脑发育的重要疾患。因此对癫痫发病机制以及治疗方法的研究显得尤为重要。近年来，国内外对中枢神经系统具有增殖和分化能力的内源性神经前体细胞的研究颇多，多种神经系统疾病可引起内源性神经前体细胞的增殖，包括外伤、缺血缺氧、癫痫等。本课题组前期研究已证实，癫痫发作可引起大鼠海马DG区内源性神经前体细胞的增殖，并在初次发作后两周左右达到高峰。本实验在此基础上研究这些增殖的内源性神经前体细胞的迁移、分化及演变过程，探讨增殖的海马区内源性神经前体细胞与癫痫发作的相互作用，为细胞治疗癫痫提供理论依据。近年来，在药物治疗研究的同时，细胞移植替代治疗成为多种神经系统的疾病治疗最为热门的研究，而且取得了一定的成果。构建合成和分泌多巴胺的细胞移植治疗帕金森氏病、合成和释放GABA细胞治疗亨廷顿病及分泌神经营养因子细胞治疗缺血缺氧性疾病等都取得了一定的成果。而且众多的神经前体细胞、干细胞、胚胎干细胞的培养和移植治疗也有了很大的进展。在癫痫的治疗方面，也有了很多细胞治疗的研究，80年代就有将富含去甲肾上腺素的蓝斑神经元移植到双侧海马治疗癫痫的实验研究；将胆碱能神经元、胚胎海马CA3区细胞移植治疗的实验研究等，这些细胞的移植对痫性发作有不同程度的抑制作用。但这些方法都有细胞取材困难、来源有限、存在免疫源性、体内存活时间不长等缺点。于是又出现了将神经干细胞、胚胎干细胞等前体细胞用于癫痫大鼠的移植研究，虽然这些细胞能在体外大量扩增，但是移植后在脑内的抗痫作用不确定，具体分化方向也不明，不能加以控制。最近细胞移植的研究集中在基因工程细胞的构建及移植治疗研究上，这些构建的细胞能在体外扩增并按需合成和分泌相关神经营养因子、神经递质或酶等。基于上述研究，本实验构建能合成和分泌GABA的永生化的神经前体细胞和胶质细胞，这些细胞能在体外大量扩增，稳定表达目的基因GAD65，将这种构建好的神经前体细胞移植到匹罗卡品诱导的慢性自发发作的癫痫大鼠海马内，观察其存活状况及对癫痫的治疗作用。第一部分癫痫大鼠海马DG区增殖的内源性神经前体细胞演变过程的研究目的：追踪观察匹罗卡品诱导癫痫大鼠模型海马DG区增殖的内源性神经前体细胞的迁移、分化及演变过程，并探讨增殖的神经前体细胞与癫痫发作的相互作用。方法：用氯化锂和匹罗卡品腹腔注射联合诱导大鼠癫痫模型，选择按Racine分级发作Ⅳ和Ⅴ级的动物入组，对照组腹腔注射生理盐水。用5-溴脱氧尿苷嘧啶（bromodeoxyuridine，BrdU）标记不同时间点增殖的内源性神经前体细胞，多唾液酸神经细胞黏附分子（polysiolylated neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）作为神经前体细胞的迁移指标，于标记后第二天取材用免疫组化的方法观察PSA-NCAM、BrdU/PSA-NCAM的表达，以观察增殖的内源性神经前体细胞的迁移。本课题前期研究已证明癫痫发作后2w是内源性神经前体细胞增殖活性最旺盛时期，本实验于增殖高峰用BrdU标记增殖的内源性神经前体细胞；以神经元核性蛋白（neuronal nuclear antigen，NeuN）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）作为成熟神经元和胶质细胞的标志物；TUNEL方法检测凋亡细胞，用免疫组化的方法及TUNEL法追踪观察标记后不同时间点BrdU/NeuN、BrdU/GFAP及BrdU/TUNEL的表达。结果：与对照组相比，实验组海马齿状回（dentate gyrus，DG）区PSA-NCAM的阳性细胞在首次癫痫发作后3d开始增加（P＜0.05），14d达到高峰（P＜0.05），28d下降，但仍高于对照组（P＜0.05）；PSA-NCAM/BrdU阳性细胞有相似的变化趋势。与对照组相比，实验组大鼠海马区出现的BrdU阳性细胞明显增多，增殖的细胞大多数分化为神经元（约70％），只有少数分化为星形胶质细胞，随标记时间延长，增殖细胞的存活数目逐渐减少，部分BrdU阳性细胞表现为TUNEL阳性。结论：癫痫发生后大鼠海马DG区出现神经前体细胞的增殖、迁移及分化，即出现了神经发生和可塑性改变。这些增殖迁移的细胞大多数分化为神经元，但只有少部分细胞存活下来参与海马结构的重建。第二部分能合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞和星形胶质细胞的构建目的：构建能合成和分泌GABA（gamma-aminobutyric acid，GABA）的永生化神经前体细胞和星形胶质细胞。方法：在原代培养的大鼠神经前体细胞和星形胶质细胞内转入猴肾病毒40大T抗原基因（simian virus 40 large T antigen gene，SV40Tag）使其永生化（这一部分由本院麻醉科田玉科教授实验室完成）。在这些细胞内转入含谷氨酸脱羧酶65亚型（glutamate decarboxylase 65，GAD65）目的基因的质粒，对照组转染β-gal，用G418作抗性筛选出单克隆细胞株，扩大培养。应用免疫组化及Western-blot方法检测转染后细胞GAD65的表达；应用毛细管电泳法检测这些细胞细胞内外的GABA含量，观察构建细胞是否持续合成和分泌GABA；用全细胞膜片钳记录构建细胞的GABA电流，检测构建细胞的功能。结果：与转染β-gal（β-半乳糖苷酶）的对照组相比，转染GAD65的实验组在具备本身的细胞特性之外，能稳定表达GAD65，细胞内的GAD65含量明显增加；同时细胞内的GABA的含量明显高于对照组；监测细胞外液GABA的浓度观察细胞分泌GABA的能力，实验组明显高于对照组；用全细胞膜片钳记录到了GABA电流，电流明显增大，说明构建细胞功能完善。结论：永生化的神经前体细胞和星形胶质细胞中转入GAD65质粒后，细胞能稳定表达GAD65，并且能合成和分泌GABA。第三部分能合成和分泌GABA的神经前体细胞癫痫大鼠脑内移植的实验研究目的：将上述构建好的能合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞移植到癫痫大鼠的脑内，应用MRI成像、免疫组化、行为学观察、脑电图等多种方法观察这些细胞在癫痫大鼠脑内的存活、分化及对癫痫的治疗作用。方法：实验组应用氯化锂和匹罗卡品联合诱导癫痫自发发作模型，将上述稳定培养的能合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞用超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）标记后，于首次癫痫发作后4w移植入癫痫大鼠的海马内，移植后1w、3w、7w MRI扫描追踪观察细胞的存活状况；以SV40Tag作为移植细胞的标志物，免疫组化方法观察移植细胞在脑内的存活及分化演变；对照组移植入D-Hank’s液，观察对照组和实验组大鼠在行为学、脑电图的改变。结果：SPIO标记的细胞移植到癫痫大鼠右侧海马DG区，行1.5T MRI检查，见移植处在T2WI呈低信号改变，移植后7w仍可见移植处的低信号改变。移植细胞在脑内存活，表现为SV40Tag阳性，并同时表现GAD65阳性，在海马DG区可表达NeuN和GFAP阳性，以神经元为主，证明细胞能在脑内存活分化；但在针道瘢痕处的移植细胞几乎全表现为GFAP阳性。与对照组（移植D-Hank’s液）相比，实验组动物死亡率降低（样本量少，Fisher’s检验无统计学意义）；行为学观察发现，自发痫性发作次数明显减少；脑电图改善，痫波发放明显减少。结论：在癫痫大鼠脑内移植合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞能在脑内存活及分化，并能改善痫性发作。小结本论文第一部分证实氯化锂和匹罗卡品联合诱导的癫痫发作后大鼠海马DG区有内源性神经前体细胞的增殖、迁移及分化，而且大多数增殖的细胞分化为神经元。但是随时间推移，大多数增殖的细胞在脑内存活时间不长，不能明显改善癫痫发作引起的海马损伤、神经元的丢失和抑制性神经递质的减少。那么，在第二部分里，我们将GABA合成限速酶——谷氨酸脱羧酶（GAD65）导入永生化的神经前体细胞和星形胶质细胞里。在离体多项实验观察到构建的基因工程细胞能大量增殖并稳定表达GAD65，能合成和分泌GABA。在第三部分里，我们把这种构建好的永生化神经前体细胞移植到氯化锂和匹罗卡品联合诱导有自发发作的慢性癫痫模型的大鼠海马内，实验观察到这些细胞能在大鼠脑内存活分化，在行为学、脑电图上对癫痫均有明显改善。在目前看来，这个实验仍是成功的和有意义的，下一步的研究将是利用GAD65质粒中的可控基因，研究这种工程细胞离体和在体分泌GABA的可控性，及这种细胞长期存活状况及治疗效果。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一部分 癫痫大鼠海马DG区增殖的内源性神经前体细胞演变过程的研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 能持续合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞和星形胶质细胞的构建
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 能合成和分泌GABA的神经前体细胞癲痫大鼠脑内移植的实验研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 一 神经发生与癫痫
• 二 细胞移植与癫痫
• 博士期间发表和待发的文章
• 致谢