丙型肝炎病毒F蛋白在肝癌发生发展中作用的研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计，目前全世界约有1.8亿HCV感染者，且呈增长趋势。HCV是单股正链RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高达75%85%，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对人类的健康和生命构成了严重威胁。丙型肝炎病毒属黄病毒属，全长约9.6kb，为颗粒状单股单股正链RNA，分为5’非翻译区（UTR）、一个开放读码框（ORF）和3’非翻译区，编码一个由3000多个氨基酸组成的复合蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少10种基因产物：四种结构蛋白（C，E1，E2，p7）和六种非结构蛋白（NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B）。C蛋白被认为与不同程度的肝脏炎症和纤维化、肝硬化、甚至肝癌相关。对C蛋白的研究表明，它能转录性上调许多细胞因子的活性，如c-myc、c-fos和Bcl-2，通过激活NF-кB从而抑制有Fas或TNF诱导的凋亡，并与ras基因协同使肝细胞向肿瘤表型和肝癌细胞的转化，说明C蛋白有癌基因的特性。除了以上发现的十种蛋白外，最近研究者发现了一种新的蛋白即F蛋白，它是C基因移码读框后所形成的新基因产物。最新的报道显示，F蛋白能够引起细胞内NF-кB的持续激活，从而增强细胞抵抗TNF-α诱导凋亡的能力。F蛋白是C基因移码读框后所形成的，与C蛋白同时存在， F蛋白在在肝癌发生发展中作用具有哪些作用？本研究拟一方面通过实验观察F蛋白的表达对细胞的恶性转化作用；另一方面观察F蛋白的表达对于抑癌基因Bax、原癌基因Bcl-2的表达以及对细胞凋亡的影响，以期阐明HCV的致病机理，为HCV疫苗的发展提供依据。第一部分HCV1b型F蛋白的表达导致转染细胞的转化和肿瘤的形成将本实验室已经构建好的含有HCV1b型F基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-F利用脂质体转染到Chang-liver细胞中，以转染含有C基因的pcDNA3.1-C、pcDNA3.1的Chang-liver作为对照，转染后的细胞用G418筛选出稳定转染的细胞，分别命名为Chang-liver-pcDNA3.1-C、Chang-liver-pcDNA3.1-F，进行软琼脂集落形成实验和接种于裸鼠背部皮下，收获瘤体，并进行病理学鉴定。结果显示，在转化实验中，HCV-F蛋白的表达可以提高转染的Chang-liver细胞增殖率，C蛋白的表达也可以诱导细胞的转化；裸鼠在接种Chang-liver-pcDNA3.1-C细胞9天后开始出现肿瘤，接种Chang-liver-pcDNA3.1-F的裸鼠在第14天出现肿瘤，连续观察50天后处死裸鼠，病理学鉴定肿瘤组织结构符合肝细胞癌形态特点。研究结果表明，HCVF和C蛋白能导致正常肝细胞发生转化，提示F蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有直接关系。第二部分丙型肝炎病毒基因1b型F蛋白对原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的调节作用应用PCR技术扩增HCV1b型的F基因，构建pEGFP-C3-F真核表达载体,利用脂质体转染到HepG2细胞中，以转染pEGFP-C3-C、pEGFP-C3质粒的细胞作为对照组，转染后的细胞用G418筛选出稳定转染的细胞，分别命名为HepG2-pEGFP-C3-F、HepG2-pEGFP-C3-C，进行细胞凋亡检测和抽细胞总蛋白质，Western Blot检测Bcl-2、Bax表达的变化。凋亡检测结果显示，与转染pEGFP-C3细胞相比，F和C这两种基因都能抑制细胞的凋亡；含F和C基因的HepG2中Bcl-2、Bax表达水平都显著高于对照组的细胞，且含F基因的HepG2与含C基因的HepG2相比Bcl-2、Bax蛋白的表达水平没有显著区别（P>0.05）。研究结果表明：HCV F蛋白具有调节调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性，可能与肝炎慢性化和肝癌的形成有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 HCV 1b F 蛋白的表达导致转染细胞的转化和肿瘤的形成
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 HCV 1b F 蛋白对原癌基因 Bcl-2 和抑癌基因 Bax 的调节作用
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 文献综述
• 参考文献
• 附录一 英文缩略表
• 附录二 发表文章
• 致谢