病原性溶藻弧菌的饥饿耐受以及复苏研究

论文摘要

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海水环境中常见菌,在一定条件下对海水动物有较强的致病性,是近年来鱼、虾、贝等海水养殖动物主要病原菌之一。了解病原菌的流行病学规律对于疾病科学防治具有重要的指导意义。营养和温度是对病原菌有重要影响的环境因子,而营养缺乏和低温是影响海洋环境中溶藻弧菌生存的主要不利因素。为了进一步了解病原性溶藻弧菌的流行病学特征,为疾病防治提供有价值的参考,本文研究大黄鱼的病原菌——溶藻弧菌在饥饿条件下的存活情况及生理、生化变化,研究饥饿和低温对溶藻弧菌活的非可培养（VBNC）状态的诱导效应,进而研究活的非可培养状态溶藻弧菌对药物的敏感性,并探讨了活的非可培养状态溶藻弧菌的复苏条件。具体内容如下:将溶藻弧菌培养至对数生长期,用天然海水（NSW）洗脱,调整菌浓度至107个/ cm3左右后置于27℃恒温培养箱进行饥饿试验。采用显微镜直接计数法（DC）、平板菌落计数法（PC）、吖啶橙（acridine orange,AO）-碘化丙啶（propidium iodide,PI）荧光染色计数法（AO-PI法）分别测定样品中溶藻弧菌的总菌数、可培养菌数及死活菌比例;采用间接ELISA测定溶藻弧菌的最低检测限;采用体外粘附方法测定溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的粘附能力;采用结晶紫染色的方法观察细胞形态;对菌体蛋白的分析采用SDS-PAGE电泳。结果表明:饥饿初期细菌总数、可培养菌数和活菌数都有较大幅度上升;饥饿中、后期,总菌数与活菌数缓慢下降,而可培养菌数下降速度较快;饥饿前溶藻弧菌呈短杆状、染色均匀,饥饿后许多细胞中央出现染色较浅的区域,细胞形态变为椭圆形;溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量随着饥饿时间延长而急剧下降,饥饿7d后的黏附量接近于空白;饥饿细胞对热和紫外线敏感;饥饿30d后菌体蛋白条带比饥饿前的蛋白质条带少,饥饿60d后菌体蛋白质条带比饥饿30d以及对数期时的条带多。研究结果表明溶藻弧菌在常温天然海水的环境下可至少存活2个月,形态、抗逆性、菌体蛋白等发生了改变;但是,饥饿溶藻弧菌毒力减弱,对热、紫外线敏感。通过低温（4℃）、饥饿（ASW环境）的方式诱导溶藻弧菌进入VBNC状态,之后通过提高温度,改变营养物质的含量以及加入过氧化氢降解剂的方法使溶藻弧菌从VBNC状态下复苏,以探索复苏的最佳条件。在诱导溶藻弧菌进入VBNC状态的过程中,采用DC、PC、AO-PI进行计数,采用结晶紫染色的方法观察细胞形态。结果表明,溶藻弧菌由初始5.5×107CFU/mL降低到〈0.1CFU/mL,第51d完全进入VBNC状态。采用系列稀释实验证明溶藻弧菌发生了真正的复苏。提高温度可使溶藻弧菌从VBNC状态中复苏,复苏CFU在前2个小时有个跳跃增长,CFU在24h上升至1.09×107CFU/mL。在营养琼脂（固体介质）加入不同浓度的α-酮戊二酸,CFU先上升后降低,最大值为3.82±0.22×103CFU/mL（α-酮戊二酸浓度为0.015%）。在人工海水（液体介质）中加入不同浓度的α-酮戊二酸,随着α-酮戊二酸浓度提高,CFU下降。对温度、营养、α-酮戊二酸三个复苏因素进行正交实验发现温度对复苏影响最大,α-酮戊二酸和营养物质次之。最佳条件为复苏温度为28℃,人工海水中含0.0025%α-酮戊二酸和0%浓度的营养物质。过氧化氢酶活力在低温诱导溶藻弧菌VBNC以及复苏过程中呈现先下降后上升的变化。细胞形态变小趋于椭圆形,细胞膜的通透性降低。实验结果证明了溶藻弧菌存在真正意义上的复苏,并且表明了提高温度有利于菌的复苏,而营养物质的浓度对细菌的复苏没有明显的影响,过氧化氢降解剂（α-酮戊二酸）的加入确实能降解培养基中的某些不利于细菌复苏的物质。采用药敏纸片法测定病原性溶藻弧菌对七种常用的养殖用药的敏感性,进而测定四种抗菌效果最好的药物对不同饥饿阶段的溶藻弧菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果表明:溶藻弧菌对复方新诺明、庆大霉素、硫酸链霉素、氟哌酸敏感;对红霉素、四环素中度敏感;对痢特灵不敏感;高锰酸钾、硫酸链霉素、氟哌酸、复方新诺明对对数期溶藻弧菌的MIC值分别为25.00、332.50、1.56、3.13μg/mL（u/mL）,随着饥饿时间的延长,高锰酸钾、氟哌酸、复方新诺明对溶藻弧菌的MIC值增大,而硫酸链霉素则减小。测定四种不同浓度氟哌酸对溶藻弧菌的存活以及细胞膜通透性的影响,结果表明浓度为3.13μg/mL的氟哌酸对溶藻弧菌细胞膜通透性影响较大且在第9d诱导溶藻弧菌进入VBNC状态。去除氟哌酸作用后,溶藻弧菌立即恢复可培养性,24h内复苏值达到106 CFU/mL;刚进入VBNC状态时,VBNC状态溶藻弧菌的复苏率为32%;随着进入VBNC状态时间的增加,复苏能力降低,第30d复苏率仅为2%。综上所述,病原性溶藻弧菌能在海水中长期饥饿存活并可进入活的非可培养状态;活的非可培养状态的溶藻弧菌在条件合适是能够复苏成可培养状态;饥饿状态的溶藻弧菌对药物的敏感性不同。本文的研究结果有助于进一步了解病原性溶藻弧菌的流行病学规律,对于疾病的防治也有一定的参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 溶藻弧菌
• 1.1.1 溶藻弧菌流行病学
• 1.1.2 溶藻弧菌致病机理
• 1.2 细菌的VBNC 状态研究进展
• 1.2.1 已报道存在 VBNC 状态的细菌种类及相关的诱导因素
• 1.2.2 VBNC 细菌的生物学特性
• 1.2.3 VBNC 细菌的复苏
• 1.2.4 VBNC 细菌的检测
• 1.2.5 细菌 VBNC 状态的理论及实际意义
• 1.3 溶藻弧菌的饥饿耐受研究
• 第二章 溶藻弧菌的常温饥饿耐受研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 饥饿实验
• 2.1.3 细菌计数
• 2.1.4 细菌细胞形态观察
• 2.1.5 体外粘附实验
• 2.1.6 紫外线处理
• 2.1.7 热处理
• 2.1.8 细菌蛋白分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 饥饿对溶藻弧菌存活的影响
• 2.2.2 细胞形态观察
• 2.2.3 对大黄鱼表皮粘液的粘附作用
• 2.2.4 紫外线处理
• 2.2.5 热处理
• 2.2.6 蛋白质分析
• 2.3 讨论
• 第三章 低温饥饿诱导溶藻弧菌进入VBNC 状态
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 溶藻弧菌VBNC 状态的诱导
• 3.1.3 细菌计数
• 3.1.4 细菌形态观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 饥饿、低温对溶藻弧菌VBNC 状态的诱导效应
• 3.2.2 细菌形态观察
• 3.3 讨论
• 第四章 溶藻弧菌从VBNC 状态的复苏
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 细菌生长曲线的测定
• 4.1.3 复苏试验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 VBNC 状态细胞的可复苏性测定
• 4.2.2 提高温度对溶藻弧菌复苏的影响
• 4.2.3 α-酮戊二酸对 VBNC 状态溶藻弧菌复苏的影响
• 4.2.4 在人工海水中加入α-酮戊二酸的复苏
• 4.2.5 细胞膜的通透性
• 4.2.6 过氧化氢酶活性变化
• 4.2.7 复苏最适条件研究
• 4.3 讨论
• 第五章 饥饿状态下的溶藻弧菌对药物的耐受性
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 细菌培养及饥饿条件
• 5.1.3 细菌计数
• 5.1.4 敏感药物筛选
• 5.1.5 溶藻弧菌饥饿细胞的药物敏感性试验
• 5.1.6 氟哌酸诱导溶藻弧菌 VBNC 状态
• 5.1.7 溶藻弧菌细胞膜通透性的测定
• 5.1.8 VBNC 细菌的复苏试验
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 饥饿对溶藻弧菌存活的影响
• 5.2.2 敏感药物筛选结果
• 5.2.3 溶藻弧菌饥饿细胞的药物敏感性变化
• 5.2.4 饥饿和不同浓度的氟哌酸对溶藻弧菌存活的影响
• 5.2.5 对细胞膜通透性的影响
• 5.2.6 证明复苏
• 5.2.7 复苏能力的变化
• 5.3 讨论
• 第六章 小结与展望
• 6.1 小结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文目录