耐辐射球菌DNA修复基因sbcC和sbcD的功能研究

论文摘要

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）不仅对致死剂量的电离辐射具有极强的抗性,而且它对其它形式的DNA损伤因子,例如紫外线、过氧化氢,干燥等也具有很强的抵抗能力。电离辐射能够诱导产生大量的DNA双链断裂（DNAdouble-stranded breaks,DSBs）,而DNA双链断裂是一种最致命的DNA损伤形式。耐辐射球菌的电离辐射抗性主要是与它的超强的DNA双链断裂修复能力有关。但是迄今为止,人们对它的抗性分子机制仍然知之甚少。通过基因组测序和比较基因组学的研究,发现耐辐射球菌中所有与DNA修复相关的基因均可在其他原核生物中找到相应的同源物。但与大肠杆菌参与同源重组修复相关基因的比较显示,耐辐射球菌没有编码RecBC,RecET和SbcB等重组酶的基因。这意味着在耐辐射球菌中根本不存在RecBC和RecET修复途径。由于在耐辐射球菌中只有SbcCD和RecFOR被保留下来,推测它们可能参与DNA双链断裂损伤的修复。但是这两个途径在耐辐射球菌细胞内的真正的具体作用还不清楚。通过生物信息学的研究发现,耐辐射球菌SbcD和SbcC同属于Mre11-Rad50蛋白家族,它们在进化中非常保守,并分布于所有的生物中。在真核生物中,Mre11和Rad50分别是SbcD和SbcC的直系同源物,它们与Nbs1蛋白共同构成了MRN复合体。MRN复合体处于DNA修复和细胞周期调控的关键位置。当DNA双链断裂损伤产生后,MRN复合体可快速与损伤部位结合,参与起始的DNA损伤末端处理。在MRN复合体中,任何一个亚基的基因突变都会引起生物体对DNA损伤超敏感、基因组不稳定、端粒缩短和减数分裂异常。由此可以猜测耐辐射球菌SbcCD复合体可能在DSBs和其它DNA损伤的修复过程中起重要的作用。本课题选择耐辐射球菌SbcD（DR1921）和SbcC（DR1922）作为研究对象,运用生物信息学和生物化学与分子生物学的手段,对它们的体内的遗传学功能、体外的酶学功能和基因组的转录水平的变化进行研究,以此来重新全方位的理解SbcCD复合体在DNA代谢和修复中的地位和作用。主要内容和实验结果如下:1.利用定点反向插入突变技术,构建了sbcD基因突变株,并研究了它在体内的遗传学功能。对sbcD突变体在各种胁迫处理下的生存率分析表明:突变株D细胞对电离辐射、丝裂霉素C,紫外线和过氧化氢等DNA损伤试剂表现出非常强烈的敏感性。由于这些DNA损伤试剂引起的DNA损伤机制不同,从而产生的DNA损伤类型也相互之间各不相同。因此,耐辐射球菌SbcD蛋白可以参与多种不同类型的DNA损伤修复,它是一个重要的DNA损伤修复蛋白。在正常生长条件下,sbcD基因突变后的细菌不仅生长速度变得缓慢,而且生物量也减少了,表明sbcD基因是细菌生长的必需基因。通过脉冲场电泳比较了野生株R1和sbcD基因突变株辐照处理后的基因组修复动力学。结果显示sbcD基因突变株在电离辐照后,它的基因组修复时间要显著的比野生株R1要长。这证明耐辐射球菌sbcD基因是一个维持基因组稳定性的关键基因,它对维持耐辐射球菌完整的基因组具有重要的贡献。2.利用原核表达系统在大肠杆菌中大量诱导表达drSbcD和drSbcC蛋白,并对drSbcD和drSbcC蛋白分别进行纯化,然后使用纯化后的drSbcD和drSbcC蛋白在体外重建drSbcCD复合体,最后对drSbcCD复合体再进行纯化,并对其体外酶学功能进行分析研究。结果显示:drSbcCD复合体具有ATP非依赖型的核酸内切酶活性和3’→5’的ATP非依赖型的核酸外切酶活性。除此而外,它还具有3’flap DNA和茎环结构DNA等特殊结构DNA的核酸内切酶活性。这证明drSbcCD复合体在体外可以作用于不同结构类型的DNA底物。由此可以推测drSbcCD复合体在体内同样具有识别多种异常结构DNA的能力,参与多种DNA代谢和修复途径。3.利用基因芯片技术探索了sbcD突变株的基因转录谱在正常生长状态下和在6K Gy剂量的电离辐照胁迫下的变化情况。在正常生长状态下,sbcD基因的突变使DRC染色体上76%基因的转录水平发生了2倍以上的上调,其中部分是与转座子转座和拆分相关的基因。这说明sbcD基因具有抑制转座子转座的作用。但在6K Gy剂量的电离辐照胁迫下,sbcD突变株中许多重要的参与DNA修复的基因,如dnlJ、gyrB、recA、recD、recN、ssb、uvrA、uvrB、uvrD、recG、ddrB,ddrC,ddrD和pprA等基因的转录水平的变化趋势与野生株在强剂量辐射和长期干燥条件下的趋势很相似。这说明在电离辐射状态下,SbcD蛋白在胁迫状态下参与DNA损伤位点的结合,从而使平时的抑制位点被释放出来,使其通过插入序列,加速同源重组过程,将DNA双链断裂片段重新组装成完整的染色体。综上所述,耐辐射球菌SbcD和SbcC可以自组装为SbcCD复合体,它作为一个重要的多功能蛋白,通过多种DNA修复途径来实现耐辐射球菌的极端耐辐射特性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 耐辐射球菌电离辐射抗性研究进展
• 1.1.1 耐辐射球菌的发现
• 1.1.2 耐辐射球菌的形态和结构
• 1.1.3 耐辐射球菌的系统进化
• 1.1.4 耐辐射球菌的电离辐射抗性与干旱抗性的关系
• 1.1.5 耐辐射球菌的基因组、转录组和蛋白质组分析
• 1.1.6 耐辐射球菌的抗性机制
• 1.1.7 小节
• 1.2 SbcCD及其同源蛋白与基因组稳定性的关系
• 1.2.1 真细菌来源的SbcC和SbcD蛋白
• 1.2.2 真核细胞和古细菌来源的Rad50和Mre11蛋白
• 1.2.3 小节
• 1.3 本课题的研究意义
• 2 耐辐射球菌sbcC和sbcD基因的生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 数据库
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 DR1921和DR1922基因的序列分析
• 2.3.2 密码子偏好性分析
• 2.3.3 启动子预测
• 2.3.4 蛋白结构域分析
• 2.3.5 多序列同源比对和活性位点分析
• 2.3.6 耐辐射球菌的SbcC和SbcD蛋白同源物的进化树分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小节
• 3 耐辐射球菌sbcD基因突变株的构建及体内遗传学功能的分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株,质粒和培养条件
• 3.2.2 主要试剂和仪器
• 3.2.3 耐辐射球菌基因组DNA的提取
• 3.2.4 DR1921突变株的构建
• 3.2.5 耐辐射球菌转化
• 60Co电离辐射处理后生存率的测定'>3.2.6⁶⁰Co电离辐射处理后生存率的测定
• 3.2.7 紫外线处理后生存率的测定
• 3.2.8 过氧化氢处理后生存率的测定
• 3.2.9 丝裂霉素C处理后生存率的测定
• 3.2.10 耐辐射球菌R1和突变体D的生长动力学曲线
• 3.2.11 脉冲场凝胶电泳
• 3.2.12 抗氧化活性分析
• 3.2.13 过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性染色分析
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 sbcD突变株的构建和鉴定
• 3.3.2 sbcD基因突变株对DNA损伤试剂敏感性显著增加
• 3.3.3 sbcD突变株的抗氧化胁迫分析
• 3.3.4 sbcD基因突变株D的生长动力学分析
• 3.3.5 辐照胁迫下sbcD基因突变株的完整基因组恢复明显的延迟
• 3.4 讨论
• 3.5 小节
• 4 耐辐射球菌SbcCD复合体的体外酶学活性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株、质粒和培养条件
• 4.2.2 实验材料和仪器
• 4.2.3 耐辐射球菌sbcC和sbcD基因的克隆
• 4.2.4 耐辐射球菌SbcC和SbcD蛋白的表达质粒的构建
• 4.2.5 耐辐射球菌SbcC和SbcD蛋白的表达
• 4.2.6 耐辐射球菌SbcC和SbcD蛋白的纯化
• 4.2.7 耐辐射球菌SbcCD蛋白复合体的重建
• 4.2.8 寡核苷酸底物的合成与制备
• 4.2.9 质粒底物
• 4.2.10 核酸酶反应
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 耐辐射球菌的SbcC和SbcD的表达质粒构建
• 4.3.2 耐辐射球菌的SbcC和sbcD蛋白的诱导表达
• 4.3.3 耐辐射球菌SbcCD蛋白复合体的体外重建和纯化
• 4.3.4 耐辐射球菌SbcCD复合体具有ATP非依赖性的3'→5'核酸外切酶的活性
• 4.3.5 不同二价金属离子对耐辐射球菌SbcCD复合体核酸外切酶的影响
• 4.3.6 耐辐射球菌SbcCD复合体核酸内切酶的活性分析
• 4.3.7 耐辐射球菌SbcCD复合体具有3'flap核酸酶活性
• 4.3.8 耐辐射球菌SbcCD复合体具有识别特殊DNA结构的核酸酶活性
• 4.3.9 耐辐射球菌SbcCD复合体具有发夹或茎环结构核酸酶活性
• 4.3.10 耐辐射球菌SbcCD复合体具有蛋白封闭DNA末端的3'→5'核酸酶外切酶活性
• 4.4 讨论
• 4.4.1 耐辐射球菌SbcCD复合体的构成
• 4.4.2 耐辐射球菌SbcCD复合体的核酸外切酶活性
• 4.4.3 耐辐射球菌SbcCD复合体的核酸内切酶活性
• 4.4.4 耐辐射球菌SbcCD复合体的3'flap核酸酶活性
• 4.4.5 耐辐射球菌SbcCD复合体的DNA二级结构核酸酶活性
• 4.4.6 耐辐射球菌SbcCD复合体的蛋白封闭末端DNA的核酸外切酶活性
• 4.5 小节
• 5 耐辐射球菌sbcD突变体基因表达谱差异分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 耐辐射球菌基因芯片的制备
• 5.2.2 耐辐射球菌的处理
• 5.2.3 耐辐射球菌的总RNA的分离
• 5.2.4 芯片探针的制备
• 5.2.5 芯片预杂交和杂交
• 5.2.6 芯片扫描及数据分析
• 5.2.7 实时定量PCR
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 sbcD突变株转录谱分析
• 5.3.2 电离辐射胁迫下sbcD突变株转录谱分析
• 5.3.3 电离辐射胁迫下sbcD突变株与野生株R1的转录组的比较
• 5.4 讨论
• 5.5 小节
• 6 总结与展望
• 参考文献
• 博士期间发表的文章