论文摘要
背景:骨肉瘤为恶性骨肿瘤中最常见者,其显著特点是青少年发病率高、恶性程度高、早期转移率高而预后差。因此,从根本上探求骨肉瘤发生、发展及其转移机制,寻求有效处理骨肉瘤原发病灶,预防、及早发现和有效的治疗肺转移对改善肉瘤患者的预后至关重要。目前研究认为,肿瘤的发生与癌基因激活,抗癌基因失活及其它基因的表达失控有关,是多种相关基因多阶段多途径协同作用的结果。基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列,该技术由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念,具有高效、高信息量的突出优点。本研究中,我们使用骨肉瘤细胞株作为模型用以研究基因表达水平对于骨肉瘤发病及演变的重要意义。本实验以骨肉瘤细胞系（MG-63,U-2OS）和成骨细胞系hFOB1.19为研究对象,应用SBC的人16K基因表达谱cDNA芯片（含已知基因12581个）,通过一次重复,鉴定已知基因在骨肉瘤细胞与正常成骨细胞中的差异表达情况并以临床切除的骨肉瘤新鲜标本及两个骨肉瘤细胞系为对象,进一步在mRNA水平上对显著差异表达的基因进行了验证。目的:1、在基因组水平上对骨肉瘤发病及转移相关基因群进行筛选。2、完成对骨肉瘤发病及转移机制的初步探索,为骨肉瘤的基因诊断、基因治疗提供靶基因。3、为进一步进行骨肉瘤发病及转移相关基因敲除与转染研究奠定前期基础。方法:1、细胞培养及骨肉瘤标本收集:两个骨肉瘤细胞系（MG-63、U-2OS）及一个成骨细胞系（hFOB1.19）购自中国科学院上海细胞所。细胞培养所有用于芯片实验的细胞均处于对数生长期。实验所用的骨肉瘤组织标本为2007年6月至8月第二军医大学长海医院骨科手术切除标本,术中切除后立即置入液氮罐中冻存备用。2、实验细胞株总RNA抽提及探针合成:将三个实验用细胞株抽提总RNA。采用TRIzol法抽提总RNA、QIAGEN’s RNAeasy mini kit纯化总RNA（具体见QIAGEN公司提供的说明手册）。抽提总RNA的浓度和质量采用分光光度计及琼脂糖胶电泳测定。双链cDNA的合成、荧光标记cRNA的合成以及cRNA的片段化等过程严格遵循SBC芯片表达分析实验方法。3、芯片杂交:将前诉制备好的生物素标记的cRNA于四张SBC表达谱芯片上杂交过夜（芯片各做一组重复,共四张）。芯片杂交后的洗涤、染色过程遵照标准的SBC表达谱芯片实验指南进行。4、数据分析:芯片结果采用Aligent Scanner来获取图像,通过Imagene转化为数值后应用Genespring分析软件将数值进行标准化,取得差异倍数值。我们将两个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株之间差异表达平均倍数（芯片重复一次）=2.0倍或=0.5者筛选出来,从筛选出的基因（2组上调、2组下调）中选择两组骨肉瘤细胞株相对成骨细胞株共同差异表达的基因（上调和下调）。对共同差异表达基因的分析借助于GenBank数据库、Genespring等综合完成。5、实时定量RT-PCR验证:引物的设计,登录GENEBANK网站,以4个差异表达基因为模版设计上、下游引物。嵌合荧光法(SYBR?Green I)实时RT-PCR:采用ABI SYBR（?） Green荧光定量PCR方法（具体反应体系见ABI SYBR（?）Green RT-PCR方法说明）。结果:1、骨肉瘤细胞株与成骨细胞株差异基因表达情况:以表达差异=2.0倍或=0.5为限,在SBC人16K基因表达谱cDNA芯片包含的约12581个已知基因中,两个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株hFOB1.19相比较的差异表达情况如下:MG-63上调842个基因,下调1255个基因;U-2OS上调1040个基因,下调1430个基因。两者与成骨细胞株相比较共同上调131个基因;共同下调63个基因。在131个共同上调基因中,我们选取了MUC1（平均上调5.513和3.297倍）和ASS基因（平均上调达16.18、3.234倍）在组织标本及细胞株中对其表达进行定量PCR验证。在63个共同下调基因中,我们选择了IL-1B（平均下调0.019和0.01倍）、GDF15（平均下调0.0232和0.0473倍）两个基因在组织标本及细胞株中对其表达进行定量PCR验证。2、4个差异表达基因的实时定量PCR验证结果:我们采用实时定量PCR的方法验证了上述4个基因在临床切除的4例骨肉瘤标本及两个骨肉瘤细胞株上与成骨细胞株细胞相比较的差异表达情况。结果表明:在mRNA水平上,与成骨细胞株hFOB 1.19相比,原发骨肉瘤组织标本及骨肉瘤细胞株显示与SBC芯片同样的差异表达情况。这进一步验证了芯片结果的可靠性。结论:骨肉瘤的发病包括癌基因、抑癌基因、肿瘤相关基因在内的多种基因高度相关。一些在其他组织来源的恶性肿瘤中业已被证明与肿瘤发病相关的基因如TPD5、CLU、LSP1、MUC1、CXCL6、SERPINB2等与骨肉瘤的发病与转移密切相关。研究各差异表达基因的功能有助于揭开骨肉瘤发病与转移的机制。基因芯片技术可以成功的筛选肿瘤相关基因,是研究肿瘤发病和转移机制的有力工具。
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