论文摘要
【背景】肝细胞肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,严重危害国人的健康。流行病学和分子生物学研究发现乙型肝炎病毒（HBV）长期慢性感染是导致肝细胞肝癌的一个主要原因,乙肝病毒X基因开放读框编码的乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝细胞肝癌的发生发展中起着重要作用。HBx为HBV复制的必须条件。HBx具有反式转录激活功能,可以调节许多与肿瘤发生发展密切相关的分子的表达;HBx能结合并阻断抑癌基因p53的功能;此外HBx还能调节胞浆中的多种调节细胞增殖和分化的信号转导途径。然而,这些只能部分解释HBx在肝癌中的作用。HBx促进肝癌发生的机制未完全明了。为了进一步寻找HBx发挥作用的其它分子,我们前期的工作运用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术（RACE-PCR）克隆出了一个可以被HBx蛋白上调新基因URG11（Upregulated gene 11）,该基因定位在人的11号染色体长臂,含有13个外显子,编码区为2022个碱基对,编码约70KD的蛋白。对基因及蛋白结构域分析发现,该基因含有含有1个穿膜螺旋（Transmembrane helices: 281-297）;5个VWFC结构域和1个C-type lectin结构域;末端还有众多酪氨酸（Long tyrosines in tail）,并可能有多个磷酸化位点。VWFC结构域广泛存在生物界各种蛋白中,与细胞黏附、迁移、淋巴细胞的归巢、及信号转导密切相关;C-type lectin结构域和细胞的增殖,分化及信号通路密切相关,提示URG11可能是细胞生长的一个调节因子。进一步研究发现URG11在肝癌等恶性肿瘤中高表达,与肿瘤恶性程度相关;将其转染入肿瘤细胞可以促进肿瘤细胞的生长,还可上调Wnt信号转导通路中的关键分子β-连接蛋白（β-catenin）的表达。但URG11在组织中的详细表达分布及其促进肿瘤细胞生长的具体分子机制仍不明确,并且URG11与Wnt信号通路之间的关系也不清楚。【目的】1、检测URG11在多种正常组织及肿瘤组织中的表达分布及意义。2、检测URG11在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达及意义。3、探讨URG11与HBx在肝癌组织及细胞中表达之间的关系。4、检测URG11对肝癌细胞生长的影响。5、探讨URG11促进肝癌细胞生长的可能机制。【方法】1、免疫组化检测URG11在多种正常及肿瘤组织中的表达分布,并分析其表达差异。2、免疫组化检测URG11和HBx在肝癌、癌旁组织及正常肝组织中的表达分布,分析两者在肝癌中表达的意义及两者表达之间的关系。3、RT-PCR和Western blot检测肝癌细胞系（HHCC、HepG2和SMMC-7721）、永生化肝细胞QZG及转染HBx基因的肝癌细胞中URG11的mRNA及蛋白的表达。4、细胞组化检测肝癌细胞中URG11的表达分布。5、脂质体法将URG11基因的真核表达载体转入QZG细胞,将URG11特异siRNA载体转染入肝癌HHCC和HepG2细胞,G418筛选稳定表达的单克隆。6、MTT法绘制转染细胞及其对照细胞的生长曲线。7、流式细胞仪分析转染细胞及其对照细胞的细胞周期分布及细胞凋亡。8、平板集落形成实验检测转染细胞及对照细胞的集落形成能力。9、软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤实验检测URG11表达抑制后,肝癌细胞的体内外成瘤能力的变化。10、Western blot和RT-PCR检测转染细胞和对照细胞周期相关分子p21waf1、cyclinD1、CDK4和CDK6的变化。11、双荧光素酶报告基因实验检测URG11对Tcf/Lef信号的影响。12、Western blot检测转染细胞和对照细胞中GSK3β和β-catenin表达的变化。【结果】1、URG11在正常组织和肿瘤组织中的表达免疫组化结果显示URG11主要表达在胞浆中。在正常组织中,心、肺、脾、肾、肾上腺、膀胱、睾丸、子宫、肌肉、皮肤及胎盘组织中均可检测到不同程度的URG11表达,但在脑、胸腺、淋巴结、卵巢和前列腺组织中没有检测到URG11的表达;在肿瘤组织中,肺、肾、膀胱、甲状腺、乳腺、睾丸、卵巢及前列腺肿瘤组织中可检测到URG11的表达,但在脑、子宫、和皮肤肿瘤组织未检测到URG11的表达。URG11在甲状腺、乳腺、卵巢和前列腺肿瘤组织中的表达显著高于其对应的正常组织,在子宫和皮肤肿瘤组织中的表达显著低于其对应正常组织。在消化系统肿瘤及正常组织中,URG11在胃癌、结肠癌和胰腺癌组织中的表达显著高于其在对应正常组织中的表达。2、URG11在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达URG11阳性表达主要见于细胞质。85例肝癌标本组织中,53例URG11表达阳性,阳性率为62.35%;癌旁组织中59例URG11表达阳性,阳性率为69.41%,URG11主要表达在肝硬化组织中;在27例正常肝组织中,仅5例呈弱阳性表达,阳性率18.5%。URG11在肝癌和癌旁肝硬化组织中的表达显著高于正常组织。URG11在肝癌组织中的表达与肝癌组织的分化程度显著相关,高分化肝癌组织中URG11的表达显著高于中分化和低分化肝癌组织,但URG11在中分化和低分化肝癌组织中的表达无显著差异。在肝癌细胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可检测到不同程度的URG11 mRNA及蛋白的表达,以HHCC中表达最高,但在正常肝细胞QZG中没有检测到URG11的表达。URG11在肝癌细胞系中的表达也高于正常肝细胞。3、HBx在乙肝相关性肝癌和癌旁组织中的表达及与URG11表达的关系肿瘤细胞中HBx几乎全部表达于细胞质中,偶见部分核染色。72例乙肝相关性肝癌标本组织中,59例HBx阳性表达,阳性表达率为81.9%;癌旁组织中HBx阳性表达62例（86.1%）,HBx也主要表达在肝硬化组织中;在27例正常组织中,没有检测到HBx的表达。相关性分析发现在乙肝相关性肝癌组织中,HBx和URG11表达的相关系数为0.41（P<0.05）,并且在肝癌癌旁组织中的相关系数为0.51（P<0.05）。HBx基因稳定转染的HepG2细胞中,URG11mRNA和蛋白表达水平也增高。4、URG11对细胞生长的影响将URG11正义载体转染入QZG细胞后,发现QZG细胞生长加快,细胞由G1期进入S期的细胞比例增加;将URG11-siRNA转染入肝癌细胞HHCC和HepG2后,HHCC和HepG2细胞的生长显著减慢,锚定非依赖性生长的能力、单细胞集落形成能力以及裸鼠体内成瘤能力均显著减弱,细胞由G1期进入S期比例显著降低,但细胞凋亡不发生明显变化。5、URG11对周期相关分子的影响URG11表达上调后,周期相关分子cyclinD1、CDK4和CDK6表达被上调,p21waf1表达被抑制。URG11表达被抑制后,cyclinD1表达降低。6、URG11对Wnt信号通路相关分子的影响URG11表达升高后,β-catenin的表达增加,Tcf/Lef报告基因活性呈β-catenin依赖性的增强,cyclinD1表达也呈β-catenin依赖性的增加;URG11表达抑制后,β-catenin的表达降低,cyclinD1表达也降低;GSK3β表达不受URG11表达改变的影响。【结论】1、在不同组织来源肿瘤的发生中,URG11可能起着不同的作用;URG11在腺体上皮组织来源的肿瘤发生过程中可能起着促进作用,但在非腺体上皮组织来源的肿瘤发生过程中可能起着抑制作用。2、URG11在肝癌的发生中起着重要的作用,其表达可能主要受HBx调节。3、URG11可以调节β-catenin的表达和活性进而调节细胞周期的关键分子cyclinD1而影响肝癌细胞的生长、细胞周期及体内外成瘤能力。