microRNA在胚胎血发生中的功能及调控研究

论文摘要

microRNA是近年来发现的一类长度约为23个核苷酸的单链非编码RNA,主要由RNA多聚酶Ⅱ转录,经核糖核酸酶Ⅲ （Drosha及Dicer）剪切形成。成熟microRNA通过碱基配对与靶基因mRNA的3’-UTR相结合,造成靶基因mRNA的降解或蛋白翻译水平上受抑制,从而对靶基因的表达进行负向调控。microRNA参与多种生物学过程,对器官形成及组织分化均有重要作用。据目前文献报道,至少有30余组microRNA在成人血细胞中有独特的表达,其中多组microRNA与造血干细胞的分化有关,并且与胚胎造血中的关键因子相互作用,但它们在胚胎造血中的功能仍有待于进一步的探讨。为了揭示microRNA在哺乳动物胚胎造血中的作用,本文以小鼠胚胎干细胞诱导分化形成的拟胚体作为胚胎发育的模型。第一步,在先前实验积累数据的基础上,初步确定了在胚胎血发生中有特异性表达的候选microRNA。其次,为了验证这些候选microRNA是否能够调控胚胎血发生,我们首先构建了逆转录病毒载体,通过反转录病毒在小鼠胚胎干细胞中过表达候选microRNA。再次,我们构建了能在条件诱导过表达候选microRNA的小鼠胚胎干细胞系,可在拟胚体发育的特定时间段利用四环素诱导高表达候选microRNA,再利用实时荧光定量和流式细胞分析等方式检测血发生及胚胎发育的变化情况,并对数据进行分析后得到了候选microRNA的可能调节因子及下游靶基因。这部分工作为下一步研究这些候选microRNA的作用途径并找出它们的直接作用位点奠定了基础。另外,为了方便研究microRNA及其他外源性基因在人类胚胎干细胞中的作用,本文尝试构建了条件诱导基因表达人类胚胎干细胞系。通过在Actb基因的3’UTR区域发生同源重组,导入了四环素调控启动子,潮霉素（Hygromycine）抗性基因,定点重组酶系统元件（LoxP, Frt）等序列。在成功整合之后,就能够更进一步地定点重组入外源基因并可在四环素衍生物强力霉素诱导下表达转入的外源基因或microRNA。这个细胞系为我们研究在人类胚胎干细胞中研究基因或microRNA的功能提供了一个相当有用的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 第一节 microRNA与血发生
• 1 microRNA简介
• 2 胚胎血发生过程中的重要转录因子及与microRNA的相互调控
• 第二节 胚胎干细胞作为胚胎早期分化模型
• 第三节 通过同源重组来导入并条件性表达外源基因
• 第二章 材料与方法
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三章 结果与分析
• 第一节 microRNA与胚胎血发生
• 1 候选microRNA的筛选
• 2 利用逆转录病毒系统表达高表达microRNA
• 3 强力霉素（Dox）诱导下表达特定microRNA细胞系的建立
• 4 特定时期高表达microRNA对胚胎血发生因子的影响
• 5 特定时期高表达microRNA对三胚层发育的影响
• 第二节 同源重组构建能够条件表达外源基因的人类胚胎干细胞
• 第四章 讨论
• 第五章 参考文献
• 第六章 感谢
• 第七章 附录