山茱萸种质资源调查、评价与遗传多样性研究

论文摘要

山茱萸（Comus officinalis Sieb.et Zucc.）为山茱萸科（Cornaceae）山茱萸属多年生木本植物,以其干燥成熟果肉入药,具有补益肝肾和收敛固涩的作用,主要用于治疗眩晕耳鸣、阳痿、遗精和遗尿等症。山茱萸在我国分布广泛,由于是异花授粉植物,实生后代分离变异大,种质类型多样;此外,山茱萸生产中存在着种质混乱、病虫害严重、栽培管理粗放、采收与初加工不规范等问题。因此,系统开展我国山茱萸种质资源调查工作,利用植物学、分子生物学、统计学等多学科的技术和方法,建立山茱萸种质资源评价体系,对其遗传多样性进行研究,这将对山茱萸品质评价、品种选育和山茱萸资源的高效开发利用具有重要意义。本研究以河南、陕西和浙江等多个山茱萸主产地的栽培及野生山茱萸种质资源为调查对象,参照国家种质资源平台的标准,制定山茱萸种质描述规范、数据标准及种质描述简表,建立不同山茱萸种质ISSR分子鉴别体系,从表型、有效成分含量和分子水平对山茱萸种质资源进行了综合评价,为我国山茱萸种质资源评价、规范化栽培和品种选育等研究提供资料。主要研究内容及结果如下:（1）参照国家生物种质资源数据标准,建立了山茱萸种质资源数据标准。在此基础上对河南、陕西和浙江等三大主产区的山茱萸资源进行了全面调查,收集山茱萸种质资源100余份,整理出50份提交中国药用植物种质资源信息共享系统,并将其嫁接于陕西佛坪山茱萸种质资源圃中。同时对山茱萸生产中存在的问题进行了分析,并就资源利用及可持续发展对策提出了一些建议。（2）从果长、果径、果形系数、鲜果百粒重、种长、种径、种形系数、种子百粒重以及马钱素含量等几个方面对山茱萸种质的形态和有效成分含量做了分析,通过相关方差分析和聚类分析,探讨了山茱萸形态分化多样性和遗传多样性。方差分析结果表明,山茱萸各项指标变异较为丰富,其中马钱素含量变异范围最大,变异系数达29.7%;其次为鲜果百粒重,变异系数为21.83%,果长、果形系数的变异系数分别为11.74%和12.31%。相关性分析表明,果长与果形系数、鲜果百粒重、种长、种形系数呈强的正相关,与果径、种径相关性低;马钱素含量与其它性状的相关性不显著。（3）山茱萸种质资源形态多样性的遗传相似系数值在0.538～0.962之间。利用UPGMA法可将35份山茱萸种质划分为2大类群,成熟期晚的8号种质独成一类,其余的34份种质归为另一类,其中可按照地理来源、果实形状及大小再次聚类成亚组。（4）采用正交试验设计法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg92+)浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对ISSR-PCR反应体系进行优化分析,得到山茱萸ISSR-PCR最佳体系为:1×PCR buffer、150μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和2.0 U Taq DNA聚合酶,模板DNA浓度为20～80 ng,反应体系20μL;反应程序为94℃预变性10 min,94℃变性30 sec,57℃退火60 sec,72℃延伸60 sec,循环40次:72℃延伸10 min,4℃保存。（5）从50条ISSR引物中,筛选出9条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR-PCR扩增,9条引物共得到扩增条带179条,其中有164条呈现多态性,占91.6%。遗传相似系数变化范围为0.575～0.877。在遗传相似系数的基础上,利用UPGMA法建立了山茱萸种质资源分子水平聚类图,聚类结果可将35份种质资源划分为2大类群,第一类群为来源于陕西的20个种质,第二大类群为来源于河南、浙江以及部分陕西的种质,可以按照地理来源、果实形状及大小再次聚类为亚组。分子标记聚类结果呈现出一定的地域特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 山茱萸的研究概况
• 1.1.1 药用历史
• 1.1.2 资源分布
• 1.1.3 山茱萸种质资源研究
• 1.1.4 山茱萸资源现状
• 1.1.5 山茱萸资源利用现状
• 1.2 分子标记及其在药用植物种质资源研究中的应用
• 1.2.1 分子标记介绍
• 1.2.2 ISSR分子标记在药用植物种质资源研究中的应用
• 1.2.3 选择分子标记的标准
• 1.3 山茱萸种质资源标准数据制定的原则和意义
• 1.4 本论文的研究内容、目的、意义
• 第2章 山茱萸资源野外调查研究
• 2.1 山茱萸资源考察
• 2.1.1 考查内容
• 2.1.2 考察方法
• 2.2 山茱萸种质资源描述规范和数据标准
• 2.2.1 山茱萸种质资源描述规范制定原则和标准
• 2.2.2 山茱萸种质资源数据标准制定原则和标准
• 2.2.3 山茱萸种质资源数据标准表
• 2.3 调查结果
• 2.3.1 山茱萸资源类型
• 2.3.2 山茱萸资源产量
• 2.3.3 山茱萸生产中存在的问题
• 2.4 山茱萸资源可持续利用对策
• 第3章 山茱萸种质资源形态性状变异分析
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 数据测量
• 3.2.2 数据处理
• 3.2.3 形态聚类分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 山茱萸种实性状变异分析
• 3.3.2 山茱萸种实性状之间相关性分析
• 3.3.3 山茱萸形态聚类分析
• 3.3.4 主成分分析
• 3.4 讨论
• 第4章 山茱萸种质资源DNA指纹图谱和遗传多样性研究
• 4.1 材料、试剂及仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 研究方法
• 4.2.1 山茱萸总DNA的提取
• 4.2.2 DNA纯度的检测
• 4.2.3 山茱萸ISSR-PCR体系的建立
• 4.3 数据收集与统计分析
• 4.3.1 谱带记录
• 4.3.2 聚类分析
• 4.3.3 多态性分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 山茱萸基因组DAN的提取及纯度检测
• 4.4.2 山茱萸ISSR-PCR体系的优化及引物筛选
• 4.4.3 ISSR多态性分析
• 4.4.4 遗传相似性评价
• 4.4.5 聚类分析
• 4.4.6 主成分分析
• 4.5 讨论
• 4.5.1 山茱萸ISSR-PCR体系优化
• 4.5.2 山茱萸种质资源遗传多样性
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果