论文摘要
斑马鱼除具有观赏价值外，在遗传育种、分子生物学、毒理学等研究领域均是一种应用广泛、影响力持续上升的重要模式生物。精子超低温冷冻技术是保存遗传材料和不同遗传品系遗传多样性的有效途径。本文主要对斑马鱼精子超低温冷冻保存的方案进行了较为系统的研究。精子的采集方式对鲜精的活力影响很大。采用解剖不压碎精巢、解剖压碎精巢和不解剖挤压腹部进行精子采集方式的比较结果表明，挤压腹部的方法获得的精子活力最高（90±5％），然后是不压碎精巢的方式（88.8±3％），两者效果均明显好于压碎精巢的方式（仅68±13％）。由于不压碎精巢方式所得的有活力的精子数量是挤压腹部的20倍左右，因而被应用于本文下一步的研究。渗透压、pH、温度和稀释比例等因素均能够影响精子活力。本文对较大范围内的渗透压对斑马鱼精子活力的影响进行了研究，发现300mOsm／kg是使精子抑制的最适渗透压。稀释液的筛选实验表明，HBSS在精子激活后能够产生最高的活力。pH的筛选实验研究表明，常温条件下HBSS的最佳pH为7.5（73±6％），而4℃条件下pH8.0的活力最好（90±5％），但pH6.5、7.0、6.5和8.0的精子活力没有显著意义的差异（P＞0.05）。鲜精在室温（25℃）和4℃保存下，于4h以内没有显著意义的差异，但超过4h后，室温保存的活力迅速降至65±7％，而4℃条件下的精子在8～10h后仍有80％左右活力。为了加大精液的体积方便以实验的操作，本文对稀释比例进行了筛选，发现精巢与Hank’s平衡盐溶液（hanks’ balanced salt solution，HBSS）的稀释比例为1∶50时，可使精液在4℃下2h内的活力仍有87±6％。用去离子水、3％NaCl和HBSS170作为激活液，精子的瞬间活力并没有显著意义的差异（P＞0.05），但用去离子水激活后的精子的寿命较另两种方法稍长。为了快速鉴定精子的浓度，采用分光光度法对405、450、490、630nm四种波长下的吸光值进行了比较，发现405nm处的相关性为佳（r2=0.823，P＜0.05）。因此，使用405nm波长测定精子浓度的方法用于本文以后的研究。鲜精受精率和孵化率的实验表明，鲜精的精卵比以1.32×106：1产生了最高的孵化率（37.6±21.7％），因此该比例被用于本文后面的授精实验。抗冻剂毒性实验表明，鲜精的精子活力在10％甲醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、丙二醇（propylene glycol,PG）作为抗冻剂时显著低于浓度为5％的（P＜0.01）。抗冻剂的筛选实验表明，虽然二甲基甲酰氨（N，N-dimethyl acetamide,DMA）解冻后活力（21.7±7.7％）低于8％DMSO（26.70±11.60％），但该抗冻剂产生了最高的受精率（31.3±13.7％）和孵化率（60.5±0.9％）。平衡时间的筛选实验表明，10、30和60min的平衡时间的解冻后活力之间没有差异，但考虑到抗冻剂的毒性与实际操作的需要，平衡时间以30min为宜。虽然冻精解冻后的受精率和孵化率在-0.5、-5、-15和-25℃／min之间并没有极显著意义的差异（P＞0.05），但-5℃／min的冷冻速率所获冻精的解冻后活力显著较高（P＜0.01）。总之，如果以8％DMA作为抗冻剂，以-5℃／min的速率将精子从4℃降至-30℃，再以-45℃／min从-30℃降至-80℃，平衡5min后浸入液氮的降温程序，可以获得较高的受精率（如34.3±12.8％）和孵化率（如41±13.2％）。虽然受精率与鲜精（74.6±5.5％）差别较大，但是孵化率却超过了鲜精（27.1±0.8％）的水平。