一氧化氮对植物细胞次生代谢产物合成的调控作用及其信号转导机理研究

论文题目: 一氧化氮对植物细胞次生代谢产物合成的调控作用及其信号转导机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 徐茂军

导师: 朱睦元

关键词: 次生代谢产物,一氧化氮,信号转导,茉莉酸,水杨酸,活性氧,红豆杉,金丝桃,粉葛

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养法生产植物天然产物技术产业化应用的核心问题之一，理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基础。植物体内次生代谢物质的生物合成受到细胞内部和外界因素的严格调控，然而目前对植物细胞次生代谢产物合成的调控机理所知甚少。与初生代谢相比，植物次生代谢产物的合成具有更加复杂的调控机制，并且更易受外界因素的影响。细胞内部的信号转导系统是介导外界因子影响植物次生代谢产物合成的纽带。然而，目前对植物细胞中次生代谢信号调控系统的了解还十分浮浅。存在的主要问题是对植物细胞中与次生代谢产物合成调控有关的信号分子和信号转导途径的了解不够。因此，研究探讨参与植物细胞次生代谢产物合成调控的信号分子及其信号转导机制对理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律具有重要意义。NO是一种兼有水、脂溶性的小分子物质，其在动物体内的信号分子作用已为人们所熟知。早在上个世纪70年代，人们就已经发现植物可以产生NO。但是直到Delledonne和Durner两个研究小组1998年首次证实NO参与植物的抗病作用后，NO在植物体内的信号分子作用才引起研究者的重视并展开了广泛的研究。近年来，NO的植物生物学功能研究方面取得了一系列重大进展，促使NO植物分子生物学研究成为该领域的研究热点。然而，目前国内外有关NO对植物细胞次生代谢产物合成的影响及其分子机理方面的研究还十分少见。研究报道表明，NO是介导外界刺激信号从细胞表面传递到细胞核内部并诱发细胞产生诸如抗性反应、细胞超敏死亡等生理生化效应的重要信号分子。NO的这一特性使其具备了作为胞内信使物质参与外界因素对植物细胞内部次生代谢产物合成进行信号调控的基本条件，但是目前尚无直接可靠的实验证据说明NO与植物细胞次生代谢调控之间的关系。基于上述研究现状，本文以真菌诱导子为外界刺激因子，系统地研究了NO在诱导子诱发植物细胞次生代谢产物生物合成过程中的作用，取得了一系列原创性研究成果。试验结果首次证实NO是介导外界刺激信号(诱导子)诱发植物细胞次生代谢物质合成的一个重要胞内信号分子；发现NO可以依赖JA、ROS等信号途径触发植物细胞次生代谢产物的合成；证实NO和JA信号分子之间存在着特殊的自催化协同放大效应；揭示了NO可以促进植物细胞中SA积累，而SA抑制细胞中JA合成的事实，澄清了目前国际学术界有关NO抑制

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 植物细胞培养法生产次生代谢产物

1.1.1 植物细胞培养法生产次生代谢产物研究现状

1.1.2 植物细胞次生代谢产物合成信号调控规律的研究意义及现状

1.2 NO在植物体内的信号分子作用

1.2.1 NO的基本特性

1.2.2 植物体内NO的来源

1.2.2.1 NOS途径

1.2.2.2 NR途径

1.2.2.3 其它酶促途径

1.2.2.4 非酶途径

1.2.3 NO的生物学功能

1.2.3.1 NO与植物生长发育

1.2.3.2 NO与植物激素

1.2.3.3 NO与非生物胁迫

1.2.3.4 NO与生物胁迫

1.2.3.5 NO与植物PCD

1.2.4 NO信号转导

1.2.4.1 cGMP信号途径

1.2.4.2 cADPR和钙调素途径

1.2.4.3 NO和cGMP活化蛋白激酶／蛋白磷酸化酶途径

1.2.4.4 不依赖cGMP的NO信号途径

1.2.5 NO与其它信号途径的互作

1.3 NO对植物次生代谢调控作用的研究现状

第二章 NO参与真菌诱导子对红豆杉细胞中紫杉醇合成和PAL活化的促进作用

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 红豆杉悬浮细胞系及培养条件

2.2.2 桔青霉细胞壁诱导子的制备

2.2.3 红豆杉悬浮细胞NO产生量测定

2.2.4 PAL活性测定

2.2.5 紫杉醇含量测定

2.2.6 红豆杉细胞的SNP、cPITO及PBITU处理方法

2.3 结果与分析

2.3.1 桔青霉细胞壁诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中PAL活化、紫杉醇合成及NO释放

2.3.2 NO对红豆杉悬浮细胞中PAL活化及紫杉醇合成的诱导作用

2.3.3 cPTIO、PBITU对桔青霉诱导子及NO诱发紫杉醇合成和PAL活化的抑制作用

2.4 讨论与结论

第三章 NO信号途径对ROS的依赖作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 红豆杉悬浮细胞系及培养条件

3.2.2 桔青霉诱导子的制备

3.2.3 红豆杉悬浮细胞的H_2O_2及O_2~-产生量测定

3.2.4 红豆杉悬浮细胞中JA含量测定

3.2.5 红豆杉细胞中LOX活力测定

3.2.6 红豆杉细胞紫杉醇产量测定

3.3 结果与分析

3.3.1 桔青霉诱导子对红豆杉细胞生长及紫杉醇产量的影响

3.3.2 桔青霉诱导子诱发红豆杉细胞中NO迸发

3.3.3 桔青霉诱导子诱发红豆杉细胞氧化迸发并产生活性氧中间体

3.3.4 红豆杉细胞中氧化迸发与NO的关系

3.3.5 桔青霉诱导子及NO诱发红豆杉细胞中紫杉醇合成对氧化迸发的依赖作用

3.3.6 过氧化氢(H_2O_2)是介导NO诱发红豆杉细胞中紫杉醇合成的信号分子

3.4 讨论与结论

第四章 NO可以依赖SA和JA信号途径促进野生型粉葛细胞和NahG转基因粉葛细胞中葛根素的合成

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 粉葛悬浮细胞系

4.2.2 NahG转基因粉葛悬浮细胞系

4.2.3 桔青霉诱导子的制备

4.2.4 粉葛细胞NO测定

4.2.5 粉葛细胞JA测定

4.2.6 粉葛细胞SA测定

4.2.7 粉葛细胞LOX活性测定

4.2.8 葛根素含量测定

4.3 结果与分析

4.3.1 桔青霉诱导子诱发粉葛悬浮细胞NO迸发、SA积累和葛根素合成

4.3.2 桔青霉诱导子诱发粉葛细胞中SA和葛根素合成积累对NO的依赖性

4.3.3 桔青霉诱导子诱发NahG转基因粉葛细胞中NO迸发及葛根素合成积累

4.3.4 NO和JA参与真菌诱导子对NahG转基因粉葛细胞中葛根素生物合成的促进作用

4.3.5 真菌诱导子诱发NahG转基因粉葛细胞中JA生物合成对NO的依赖性

4.3.6 NO依赖JA诱发NahG粉葛细胞中葛根素的生物合成

4.3.7 SA对JA合成的抑制作用

4.3.8 野生型粉葛细胞中NO信号途径对JA的部分依赖作用

4.4 讨论与结论

第五章 NO通过JA信号途径诱发金丝桃细胞次生代谢产物的合成

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 金丝桃细胞系及细胞培养条件

5.2.2 黑曲霉(Aspergillum niger)细胞壁诱导子制备

5.2.3 金丝桃素含量测定

5.2.4 NO含量测定

5.2.5 金丝桃细胞JA含量的测定

5.2.6 金丝桃细胞LOX活性测定

5.2.7 金丝桃细胞一氧化氮合酶(NOS)活性测定

5.2.8 金丝桃细胞的抑制剂实验

5.3 结果与分析

5.3.1 黑曲霉细胞诱导子诱发金丝桃素合成

5.3.2 黑曲霉细胞壁诱导子诱发金丝桃细胞NO迸发

5.3.3 黑曲霉细胞壁诱导子诱发金丝桃细胞茉莉酸(JA)合成积累

5.3.4 黑曲霉细胞壁诱导子依赖NO和JA诱发金丝桃细胞金丝桃素合成

5.3.5 黑曲霉细胞壁诱导子依赖NO诱发JA合成

5.3.6 NO依赖JA诱发金丝桃素合成

5.4 讨论与结论

第六章 NO与JA的自催化协同作用

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 NahG转基因粉葛细胞系及培养条件

6.2.2 桔青霉菌细胞壁诱导子制备

6.2.3 葛根素含量测定

6.2.4 NO含量测定

6.2.5 细胞中JA含量测定

6.2.6 细胞中LOX活性测定

6.2.7 细胞中NOS活性测定

6.2.8 NahG转基因粉葛细胞的抑制剂试验

6.3 结果与分析

6.3.1 NO通过十八烷醇途径促进NahG转基因粉葛细胞中JA含量增加

6.3.2 JA对NahG转基因粉葛细胞中NO合成的促进作用

6.3.3 NO和JA对葛根素合成的协同效应

6.4 讨论与结论

第七章 蛋白质激酶在NO信号转导途径中的作用

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.2.1 植物细胞与培养条件

7.2.2 次生代谢产物含量检测

7.2.3 植物细胞中NOS活性测定

7.2.4 植物细胞处理

7.3 结果与分析

7.3.1 真菌诱导子依赖蛋白质激酶诱发植物细胞NO迸发

7.3.2 NO对红豆杉等植物细胞生长及次生代谢产物合成积累的影响

7.3.3 NO依赖蛋白质激酶促进植物细胞次生代谢产物合成

7.3.4 NO依赖蛋白质激酶诱发红豆杉细胞氧化迸发和紫杉醇合成

7.3.5 NO依赖蛋白质激酶促进金丝桃细胞JA合成和金丝桃素积累

7.3.6 NO依赖蛋白质激酶促进粉葛细胞中SA合成和葛根素积累

7.4 讨论与结论

第八章 NO参与Bax基因对长春花细胞次生代谢产物合成的调控作用

8.1 引言

8.2 材料与方法

8.2.1 pER-8-Bax质粒构建及长春花细胞遗传转化

8.2.2 长春花细胞培养

8.2.3 蛋白质免疫分析

8.2.4 RNA提取及Nothern检测

8.2.5 长春花碱测定

8.2.6 化学诱导

8.2.7 NO含量测定

8.3 结果与分析

8.3.1 Bax基因诱导表达及其对长春花碱合成的促进作用

8.3.2 Bax基因对长春花细胞中萜类吲哚碱生物合成途径的活化作用

8.3.3 Bax基因诱导表达提高长春花碱产量

8.3.4 NO参与Bax基因对长春花碱合成的调控作用

8.4 讨论与结论

专用名词缩略表

参考文献

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致谢

发布时间: 2006-09-06

参考文献

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