新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计

论文摘要

1,3-丙二醇（1,3-propanediol）,简写为1,3-PDO,自从十九世纪被人们发现以来,以其多方面优越的特性,成为人们关注的焦点。正因为如此,1,3-PDO的生产和应用已引起众多世界跨国公司的高度重视,尤其是生物法生产。在生物法合成1,3-PDO的代谢途径中,作为限速酶的甘油脱水酶成为人们研究的核心。2003年,法国的科学家报道了一种全新的甘油脱水酶,完全无需昂贵的辅酶B12参与反应,大幅度的降低了生产成本,加快了生物法工业化生产1,3-丙二醇的步伐。令人惊奇的是,它与已知的所有依赖辅酶B12的甘油脱水酶没有任何的同源性,却与丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate formate-lyase,PFL）具有高度的同源性。这使得人们有理由相信新发现的甘油脱水酶的催化机理与PFL的催化机理十分的相近甚至是完全相同的。因此,对pfl基因的催化机理的研究就越发显得重要了。人们已经在大肠杆菌中,找到了一个可以代替1,3-丙二醇氧化还原酶基因的yqhD基因,并且已经证实该基因的引入,对1,3-丙二醇的产量有明显的提高。如果再可以在大肠杆菌中得到取代甘油脱水酶的基因,那么对1,3-丙二醇的工业化将会有巨大的推动作用。利用新型甘油脱水酶与大肠杆菌中PFL的同源性,本实验室试图通过理性设计的方法改造出以大肠杆菌基因为基础的具有甘油脱水酶活性的新酶。 本研究论文是借助计算机利用定点突变的方法对大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶进行理性设计,从而为揭示新型甘油脱水酶的催化机理以及

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 生物合成1,3-PDO
• 1.2 新型甘油脱水酶同源基因
• 1.3 蛋白质工程
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 Escherichia coli基因组总DNA的制备
• 2.2.2 丙酮酸甲酸裂解酶及其激活因子（pfl）的引物设计和PCR扩增
• 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.4 质粒DNA的大量制备
• 2.2.5 质粒DNA的小量制备
• 2.2.6 DNA的酶切与连接
• 2.2.7 连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.8 阳性克隆筛选和酶切验证
• 2.2.9 重组子的质粒PCR验证
• 2.2.10 重组菌株的诱导表达
• 2.2.11 重组酶粗酶的制备
• 2.2.12 丙酮酸甲酸裂解酶酶活力的测定
• 2.2.13 外源基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE
• 2.2.14 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.15 突变点的确定和突变引物的设计
• 2.2.16 定点突变的方法
• 2.2.17 突变体的构建
• 2.2.18 最适温度和最适pH的测定方法
• 2.2.19 Km值的粗测
• 2.2.20 半衰期的测定方法
• 2.2.21 Tm值的测定方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 野生型丙酮酸甲酸裂解酶基因（PFL）表达质粒的构建
• 3.1.1 pfl基因的克隆
• 3.1.2 野生型pfl重组表达质粒的构建
• 3.1.3 野生型pfl的SDS-PAGE分析
• 3.2 突变型丙酮酸甲酸裂解酶基因表达质粒的构建
• 3.2.1 突变型pfl的扩增
• 3.2.2 突变型pfl基因的序列分析
• 3.2.3 突变型和野生型pfl基因的SDS-PAGE分析
• 3.3 野生型和突变型PFL基因的特性比较
• 3.3.1 最适温度和最适pH的比较
• 3.3.2 粗测Km值的比较
• 3.3.3 半衰期的比较
• 3.3.4 Tm值的比较
• 第四章 讨论
• 4.1 预测算法
• 4.2 突变点的分析
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文