环丙沙星单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

论文摘要

环丙沙星（CPFX）属于氟喹诺酮类广谱高效抗菌药物,它是继诺氟沙星之后获美国FDA批准在美国上市的第二个喹诺酮类药物,对革兰氏阴性杆菌有很强的杀伤力,能抑制细菌DNA螺旋酶,抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强,且药物吸收迅速、生物利用度高、体内分布广泛,与其他抗生素无交叉耐药反应,已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一,被大量用于治疗、预防和促生长。但是由于其耐药性和潜在的致癌性,欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量,因此环丙沙星的残留检测已成为一个必检项目。本研究合成了环丙沙星人工抗原,通过免疫兔子获得免疫脾脏,利用杂交瘤技术获得高特异性的抗环丙沙星的单克隆抗体,优化了ELISA检测条件,初步建立了环丙沙星ELISA检测技术。其主要研究结果如下:1.人工抗原的合成及鉴定采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯（NHS）法合成了两种环丙沙星人工抗原,即作为免疫抗原的环丙沙星-BSA（CPFX-BSA）和作为包被抗原环丙沙星-OVA（CPFX-OVA）。通过紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱的检测结果表明人工抗原合成成功,依据紫外扫描数据计算出CPFX-BSA中环丙沙星与BSA的偶联率为1.89:1。用考马斯蓝法对合成抗原中蛋白质的含量进行测定,得到免疫抗原中蛋白质的浓度是15.9mg/mL,包被抗原中蛋白质的浓度是6.11mg/mL。2.免疫脾脏和多克隆抗体的获得用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,免疫方法为背部皮下五点注射和静脉注射的方法。免疫五次后,获得了高效价的环丙沙星多克隆抗血清,筛选出血清效价最高的1827号兔子的脾脏供细胞融合用,经测定1827号抗血清的效价达到128000。3.免单克隆抗体的制备取1827号兔子脾脏细胞与处于对数生长期的240E进行细胞融合,以50%的PEG为融合剂,HAT作为选择性培养基,铺于40块96孔板中。利用间接ELISA法筛选出阳性孔138个。将阳性孔细胞分装于24孔细胞培养板培养一周,运用间接ELISA法筛选出双阳性孔36个,再用间接竞争ELISA法从双阳性孔中筛选出亲和力高,生产状态良好的1-4A,1-12H,2-6B,2-12A,2-12B五个编号的细胞进入亚克隆,四周后采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法最后筛选出亲和力最好的2-6B-H进行扩大培养,生产单克隆抗体。4.优化了ELISA检测条件,探明了2-6B-H免疫学性质通过一系列条件优化,最终确定ELISA检测方法如下:包被原1600倍稀释,100uL每孔,4℃包被12h;PBST洗涤四次;5%甘氨酸封闭2h;小分子与2500倍稀释一抗分别按60uL+40uL比例加入,37℃孵育1h;5000倍二抗,100uL/每孔,37℃反应1h;显色底物配方:TMB 0.2g/L+0.02%过氧化氢。50uL/每孔,显色15min;2mol/L硫酸,50uL/每孔终止,OD450读数。单抗2-6B-H上清对环丙沙星有很高的亲和性,条件优化后,当环丙沙星浓度达到0.095ng/mL即可产生10%抑制率,而当浓度在1.41ng/mL时即可产生50%的抑制率,通过抑制率曲线线性拟合后的方程:y=0.0293x-1.3159,检测范围在0.19-10ng/mL之间,最低检测限是0.095ng/mL。同时2-6B-H上清对环丙沙星具有较高的特异性,除了和其他喹诺酮类小分子有较低交叉率,对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、培罗沙星的交叉反应率分别为28.8%,13.1%,11%,22.6%,20.4%。和其他抗生素以及磺胺类药物均无交叉反应。5.建立了ELISA样品检测方法应用外标法对间接ELISA法测定样品的准确度进行试验,结果得出,在牛奶中添加0.4ng/mL,2ng/mL,4ng/mL的平均回收率在63.02%-84.6%之间,变异系数在6.26%-12.2%之间。检测范围在0.76ng/mL-40ng/mL,其最低检测限达到0.38 ng/mL。而在尿液中,通过以尿液为基质建立的标准曲线对5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL的实际样品检测结果表明,其回收率在83.34%-118.8之间,变异系数介于4.51%-17.12%,最低检测限为1ng/mL。数据显示本实验建立的方法完全满足Elisa检测试剂盒要求。综上所述,本论文通过杂交瘤技术,制备出了环丙沙星兔单克隆抗体,这一结果在国内外均未见报道。此外,试验结果表明,基于该兔单抗的环丙沙星ELISA方法的检测范围可达0.19～10ng/mL,最低检测限达0.095ng/mL,特别在牛奶中检测比目前市售的几种环丙沙星或喹诺酮类检测试剂盒的具有更低的检测限,因此具有潜在的经济价值。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 氟喹诺酮类药物简介
• 1.1.1 氟喹诺酮类的结构和类型
• 1.1.2 氟喹诺酮类的理化性质
• 1.1.3 氟喹诺酮类药物的代谢动力学
• 1.2 动物食品中残留氟喹诺酮类药物的危害及监控
• 1.2.1 残留氟喹诺酮类药物的危害
• 1.2.1.1 过敏反应和变态反应
• 1.2.1.2 毒性作用
• 1.2.1.3 细菌耐药性增加
• 1.2.2 残留氟喹诺酮类药物的监控
• 1.3 环丙沙星的常用检测方法
• 1.3.1 环丙沙星简介
• 1.3.2 环丙沙星残留检测技术进展
• 1.4 兔单克隆抗体的优势
• 1.5 本课题研究路线
• 1.6 本课题的目的与意义
• 第二章 多克隆抗体的制备及特性鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要设备
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 其他材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CPFX全抗原的制备与鉴定
• 2.2.1.1 免疫原和包被原的合成
• 2.2.1.2 紫外扫描与偶联率测定
• 2.2.1.3 蛋白质含量测定
• 2.2.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.1.5 凝胶渗透色谱
• 2.2.2 免疫兔子
• 2.2.3 细胞融合脾脏筛选
• 2.2.4 多抗血清效价测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人工抗原的合成和鉴定
• 2.3.2 细胞融合脾脏筛选
• 2.3.3 1827号多抗效价测定
• 2.4 讨论
• 第三章 兔单克隆抗体的制备与鉴定及Elisa方法的建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1.主要试剂
• 3.1.2 主要设备
• 3.1.3 实验动物
• 3.1.4 细胞
• 3.1.5 其他材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞融合与杂交瘤细胞筛选
• 3.2.1.1 细胞融合
• 3.2.1.2 杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.2 Elisa条件优化
• 3.2.2.1 酶标板均一性测定
• 3.2.2.2 包被抗原使用浓度的确定
• 3.2.2.3 一抗使用浓度的确定
• 3.2.2.4 最佳封闭液的选择
• 3.2.2.5 封闭时间的优化
• 3.2.2.6 包被条件的优化
• 3.2.2.7 一抗与小分子竞争模式的选择
• 3.2.2.8 一抗与小分子添加量的确定
• 3.2.2.9 一抗竞争时间的优化
• 3.2.2.10 酶标二抗作用时间的优化
• 3.2.2.11 底物作用时间的优化
• 3.2.2.12 底物配方的优化
• 3.2.2.13 优化后的间接竞争Elisa检测方法
• 3.2.3 单抗2-6B-H上清液免役学性质测定
• 3.2.3.1 一抗亲和性测定
• 3.2.3.2 交叉反应性测定
• 3.2.3.3 条件优化后竞争标准曲线的建立
• 3.2.4 样品检测
• 3.2.4.1 样品前处理
• 3.2.4.2 ELISA准确性测定
• 3.2.4.3 ELISA精密度测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 杂交瘤细胞的筛选
• 3.3.2 Elisa条件优化
• 3.3.2.1 酶标板性能检测
• 3.3.2.2 包被抗原使用浓度的测定
• 3.3.2.3 一抗使用浓度的确定
• 3.3.2.4 最佳封闭液的选择
• 3.3.2.5 封闭时间的优化
• 3.3.2.6 包被条件的优化
• 3.3.2.7 一抗与小分子竞争模式的选择
• 3.3.2.8 一抗与小分子添加量的确定
• 3.3.2.9 竞争时间的优化
• 3.3.2.10 二抗作用时间的优化
• 3.3.2.11 底物作用时间的优化
• 3.3.2.12 底物配方的优化
• 3.3.2.13 优化后的间接竞争Elisa检测方法
• 3.3.3 单抗2-B6-H免疫学性质测定
• 3.3.3.1 亲和性测定
• 3.3.3.2 交叉反应性的测定
• 3.3.3.3 优化后一抗间接竞争标准曲线的建立
• 3.3.4 样品检测
• 3.3.4.1 牛奶样品检测结果
• 3.3.4.2 尿样检测结果
• 3.4 讨论
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 作者简历