人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因的重组表达研究

论文题目: 人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因的重组表达研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学

作者: 李春丽

导师: 何国庆

关键词: 防御素,嵌合基因,克隆表达,发酵

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 食品安全一直是人们关注的焦点,安全、天然的食品添加剂是保障食品安全的重要方面。人β防御素3（hBD3）因其广谱高效的杀菌作用和较低的细胞毒性,有望成为新型食品防腐剂。植物des-pGlul-Brazzein甜蛋白因其高甜度和对pH、热的稳定性而有望成为新型甜味剂。本课题以大肠杆菌和甲醇酵母为宿主重组表达了hBD3、des-pGlul-Brazzein以及两者的嵌合基因,并采用摇瓶发酵分析了适合三株重组大肠杆菌菌株生长和目的蛋白表达的发酵条件。主要结果如下: 采用细菌和酵母偏爱密码子分别合成了hBD3、des-pGlul-Brazzein及两者的嵌合基因片段（中间加了一段编码凝血酶酶切位点的片段）,这些编码序列被插入pET30a和pPIC9K载体,分别构建成重组载体pET-hBD3、pET-Bra、pET-hBD3-Bra和pPIC9K-hBD3、pPIC9K-Bra、pPIC9K-hBD3-Bra。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对hBD3进行了融合表达,重组hBD3融合蛋白占总蛋白的30.9%,实现了目的蛋白的高效表达。通过亲和层析和进一步酶切纯化得到了较纯的hBD3蛋白,无论是重组hBD3融合蛋白还是hBD3蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌都具有较高的抑菌活性,并且酶切后得到的hBD3蛋白的活性比重组hBD3融合蛋白高,完全可以与提取得到的天然hBD3的活性相媲美。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对des-pGlul-Brazzein进行了融合表达,重组des-pGlul-Brazzein融合蛋白占总蛋白的35%以上,通过亲和层析和进一步酶切纯化得到了较纯的des-pGlul-Brazzein蛋白,两者的相对甜度分别是蔗糖的400和600倍,在80℃作用4h后其甜味并未丧失,说明得到的甜蛋白具有较强热稳定性。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对嵌合基因hBb3-Bra进行了融合表达。hBD3-Bra融合蛋白占总蛋白的30.5%,实现了在大肠杆菌中的高效表达。融合蛋白只有很弱的杀菌活性,但甜度约为蔗糖200倍,通过凝血酶切割纯化后,得到了具有明显杀菌活性的重组hBD3融合蛋白和甜度约为蔗糖600倍的des-pGlul-Brazzein蛋白。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1 防御素

2 甜蛋白

3 pET表达系统

4 甲醇酵母表达系统

第二章 人β防御素3基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 hBD_3基因的设计合成

1．2．2 基因的连接和PCR反应

1．2．3 琼脂糖凝胶电泳

1．2．4 PCR产物的纯化和回收

1．2．5 感受态细胞的制备及转化

1．2．6 PCR产物的克隆

1．2．7 质粒的提取

1．2．8 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定

1．2．9 表达载体pET-hBD_3的构建

1．2．10 表达载体pET-hBD_3的筛选和鉴定

1．2．11 SDS-PAGE电泳

1．2．12 β防御素3的诱导表达及电泳检测

1．2．13 融合蛋白的提取和纯化

1．2．14 蛋白浓度的检测

1．2．15 重组天然蛋白的获取与纯化

1．2．17 防御素蛋白的抑菌活性检测

2 结果

2．1 hBD_3基因的构建

2．2 重组质粒pUCmT-hBb_3的鉴定

2．3 重组表达载体pET-hBD_3的鉴定

2．4 目的基因的表达与检测

2．5 目的蛋白的纯化

2．6 防御素蛋白的活性检测

3 讨论

第三章 植物des-pGlu1-Brazzein基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 甜蛋白基因的设计合成

1．2．2 基因的连接和PCR反应

1．2．3 PCR产物的纯化和回收

1．2．4 PCR产物的克隆

1．2．5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定

1．2．6 表达载体pET-Bra的构建

1．2．7 表达载体pET-Bra的筛选和鉴定

1．2．8 des-pGlu1-Brazzein基因的诱导表达及电泳检测

1．2．9 des-pGlul-Brazzein融合蛋白与天然蛋白的获取与蛋白浓度检测

1．2．10 目的蛋白活性的检测

2 结果

2．1 des-pGlu1-Bra基因的构建

2．2 重组载体pUCmT-Bra的鉴定

2．3 表达载体pET-Bra的鉴定

2．4 目的基因的表达与检测

2．5 目的蛋白的纯化

2．6 des-pGlu1-Brazzein的甜度测定

3 讨论

第四章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 hBD_3和des-pGlu1—Brazzein基因的合成

1．2．2 嵌合基因hBD_3-Bra的构建

1．2．3 PCR产物的纯化和回收

1．2．4 PCR产物的克隆

1．2．5重组质粒pUCmT-hBD_(3)-Bra的筛选和鉴定

1．2．6 表达载体pET-hBD_3-Bra的构建

1．2．7 表达载体pET-hBD_3-Bra的筛选和鉴定

1．2．8 hBD_3-Bra嵌合基因的诱导表达及电泳检测

1．2．9 hBD_3-Bra嵌合蛋白的获取与蛋白浓度检测

1．2．10 hBD_3和des-pGlu1-Brazzein的获取

1．2．11 目的蛋白的活性检测

2 结果

2．1 嵌合基因hBD_3-Bra的构建

2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定

2．3 表达载体pET-hBD_3-Bra的鉴定

2．4 嵌合基因hBD_3-Bra的重组表达与检测

2．5 目的蛋白的纯化

2．6 目的蛋白的活性检测

3 讨论

第五章 BL21-pET—hBD_3的摇瓶发酵工艺研究

1 材料与方法

1．1 菌株与培养基

1．2 实验方法

1．2．1 菌种活化

1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择

1．2．3 IPTG诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择

1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择

1．2．5 诱导温度的选择

1．2．6 菌株BL21-pET-hBD_3的生物量测定

1．2．7 诱导BL21-pET-hBD_3表达目的产物的最佳条件分析

2 结果

2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定

2．2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果

2．2．1 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．2．2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．2．3 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．2．4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．2．5 BL21-pET-hBD_3 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果

2．3．1 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．3．2 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．3．3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．3．4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3．5 BL21-pET-hBD_337℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．4 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果

2．4．1 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果

2．4．2 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTC和乳糖诱导目的蛋白表达的结果

3 讨论

第六章 BL21-pET—Bra的摇瓶发酵工艺研究

1 材料与方法

1．1 菌株与培养基

1．2 实验方法

1．2．1 菌种活化

1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择

1．2．3 IPTG诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择

1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择

1．2．5 诱导温度的选择

1．2．6 菌株BL21-pET-Bra的生物量测定

1．2．7 诱导BL21-pET-Bra表达目的产物的最佳条件分析

2 结果

2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定

2．2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果

2．2．1 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．2．2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．2．3 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．2．4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．2．5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果

2．3．1 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．3．2 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．3．3 BL21-pET-Bras以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．3．4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3．5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．4 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果

2．4．1 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果

2．4．2 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果

3 讨论

第七章 BL21-pET—hBD_3-Bra摇瓶发酵工艺研究

1 材料与方法

1．1 菌株与培养基

1．2 实验方法

1．2．1 菌种活化

1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择

1．2．3 IPTG诱导BL21-pET—hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择

1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择

1．2．5 诱导温度的选择

1．2．6 菌株BL21-pET-hBD_3-Bra的生物量测定

1．2．7 诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的产物的最佳条件分析

2 结果

2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定

2．2 BL21-pFr-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果

2．2．1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．2．2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．2．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．2．4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．2．5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果

2．3．1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果

2．3．2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果

2．3．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果

2．3．4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．3．5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果

2．4 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果

2．4．1 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果

2．4．2 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果

3 讨论

第八章 人β防御素3真核表达载体的构建

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 hBD-3基因的合成

1．2．2 基因的连接和PCR反应

1．2．3 PCR产物的纯化和回收

1．2．4 基因的克隆

1．2．5 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定

1．2．6 表达载体pPIC9K-hBD_3的构建

1．2．7 表达载pPIC9K-hBD_3的筛选和鉴定

1．2．8 pPIC9K-hBD_3质粒的线性化

1．2．9 酵母感受态细胞的制备和转化

1．2．10 整合转化子的筛选

1．2．11 GS115-pPIC9K-hBD_3的PCR鉴定

2 结果

2．1 hBD_3基因的构建

2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3的鉴定

2．3 表达载体pPIC9K-hBD_3的鉴定

3 讨论

第九章 植物des-pGlul-Brazzein基因真核表达载体的构建及其在甲醇酵母中的表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 甜蛋白基因的设计合成

1．2．2 基因的连接和PCR反应

1．2．3 PCR产物的纯化和回收

1．2．4 PCR产物的克隆

1．2．5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定

1．2．6 表达载体pPIC9K-Bra的构建

1．2．7 表达载pPIC9K-Bra的筛选和鉴定

1．2．8 pPIC9K-Bra质粒的线性化

1．2．9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选

1．2．10 GS115-pPIC9K-Bra的PCR鉴定

1．2．11 GSIl5-pPIC9K-Bra的诱导表达

1．2．12 表达产物分析

2 结果

2．1 des-pGlul-Brazzein的基因合成

2．2 重组质粒pUCmT-Bra的鉴定

2．3 表达载体pPIC9K-Bra的鉴定

2．4 GS115-pPIC9K-Bra的筛选和鉴定

2．5 GS115-pPIC9K-Bra的诱导表达

3 讨论

第十章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的合成及其在甲醇酵母中的表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．2．1 hBD_3和des-pGlu1-Bra基因的合成

1．2．2 基因的连接和PCR反应

1．2．3 PCR产物的纯化和回收

1．2．4 PCR产物的克隆

1．2．5 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的筛选和鉴定

1．2．6 表达载体pPIC9K-hBb_3-Bra的构建

1．2．7 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定

1．2．8 pPIC9K-hBD_3-Bra质粒的线性化

1．2．9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选

1．2．10 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的PCR鉴定

1．2．11 GS115-pPIC9K—hBD_3-Bra的诱导表达

1．2．12 表达产物分析

2 结果

2．1 hBD_3-Bra基因合成

2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定

2．3 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的鉴定

2．4 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定

2．5 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的诱导表达

3 讨论

结论及后续研究展望

参考文献

致谢

个人简历及攻读博士学位期间发表的论文

发布时间: 2005-07-15

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