猪圆环病毒Ⅱ型ORF2真核表达质粒构建及免疫抗体检测研究

论文摘要

本研究采用本课题组分离鉴定的猪圆环病毒分离株PCV2WHN,设计一对引物,用PCR扩增出PCV2的ORF2基因,并克隆到pUCm-T载体上,测序得ORF2基因全长705bp,编码234个氨基酸。 用KpnI和BamHI双酶切的方法处理pUCm-PCV-ORF2和真核表达载体pcDNA3.1（+）,进行连接反应,转化大肠杆菌JM109,酶切和PCR鉴定结果表明,成功构建了真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2。用碱裂解法提取并纯化真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2。 用真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2免疫小鼠（第一次免疫后两周进行第二次免疫）,用间接ELISA方法检测免疫抗体的结果表明,第一次免疫后一周产生抗体,二免后,小鼠的抗体水平迅速上升,在第4周达到高峰,其后缓慢下降,可持续11周以上。 用PCR检测了pcDNA-PCV-ORF2的机体组织器官中的动态分布。结果表明,首免后3h到28d小鼠的各种组织器官中均能扩增出目的基因片段。在第44d脑组织PCR结果为阴性,第58d能从血液、心脏及肌肉组织扩增出目的基因片段,基因片段在肌肉中的存留时间达到88天以上。 提取小鼠各组织样品染色体基因组DNA进行PCR检测研究表明,纯化的染色体基因组未扩增出条带,pcDNA-PCV-ORF2未整合到小鼠染色体上,证实了用真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2免疫的安全性。 本研究为进一步研究猪圆环病毒核酸疫苗提供了科学依据。

论文目录

• 1、前言
• 1.1 猪圆环病毒（PCV2）病研究概况
• 1.2 PCV2的分子生物学特征与目的基因选择
• 1.3 真核表达质粒与免疫原性
• 1.4 PCV2防治中存在的问题
• 1.5 前期工作基础
• 1.6 本研究的目的意义
• 2、技术路线
• 3、材料
• 3.1 毒株、细胞、菌种与动物
• 3.2 药品试剂
• 3.3 主要仪器
• 4、方法
• 4.1 猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因克隆与测序
• 4.2 真核表达质粒的构建与制备
• 4.3 pcDNA-PCV-ORF2的特异性抗体水平检测
• 4.4 pcDNA-PCV-ORF2的分布检测
• 4.5 pcDNA-PCV-ORF2的安全性检测
• 5、结果
• 5.1 ORF2基因PCR与克隆质粒酶切鉴定结果
• 5.2 ORF2基因测序与分析结果
• 5.3 构建的真核表达质粒的酶切及PCR鉴定结果
• 5.4 pcDNA-PCV-ORF2的特异性抗体水平检测结果
• 5.5 pcDNA-PCV-ORF2的分布检测结果
• 5.6 pcDNA-PCV-ORF2的安全性检测结果
• 6、讨论
• 6.1 猪圆环病毒Ⅱ型ORF2真核表达质粒的构建
• 6.2 pcDNA-PCV-ORF2的免疫抗体水平
• 6.3 pcDNA-PCV-ORF2的分布
• 6.4 pcDNA-PCV-ORF2的安全性
• 7、结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文