分子佐剂对生长抑素基因免疫的作用及其机制研究

论文摘要

以生长抑素基因（SS）与乙肝表面抗原（HBsAg，S）基因融合的真核表达质粒pES／2SS为基础，制备S／2SS与GM-CSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒及细菌DNA等，免疫小鼠及湖羊，探讨影响生长抑素基因疫苗免疫应答及促生长效果的因素，了解生长抑素基因免疫动物的作用机制，建立合适的生长抑素基因免疫程序，为最终获得经济有效的生长抑素基因免疫方法和疫苗、开发促生长、提高畜牧生产效率的新技术奠定基础。 1．S／2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建 ①pES／2SS-GMCSF表达产物抗原表位预测 应用DNA软件分析质粒pES／2SS-GMCSF及pES／2SS融合基因表达产物的结构和理化特性，发现二者S／2SS区域抗原表位一致。同样，在插入生长抑素氨基酸序列的2个区域存在抗原表位。在pES／2SS-GMCSF质粒中，S／2SS区域以外有另外的抗原表位区，推测GMCSF不改变S／SS表达产物抗原表位，且能够增强生长抑素免疫学活性。 ②S／2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建及鉴定 酶切pCS／2SS-GMCSF质粒获得GMCSF小片段，插入到pES／2SS（有终止密码子）和pEGS／2SS（无终止密码子，能表达GFP蛋白）大片段中，构建pES／2SS-GMCSF和pEGS／2SS-GMCSF；以pEGFP-N1为质粒载体，类似方法酶切pCGMCSF质粒得到GMCSF小片段，合成CpG基因退火成双链，构建成pE-GMCSF和pE-CpG基因佐剂质粒；酶切、测序鉴定表明，基因的插入位点、方向、序列完全正确。采用脂质体包裹法将重组表达质粒转染COS细胞使其表达，用间接ELISA或荧光显微镜对其表达产物进行检测。结果表明，pEGS／2SS-GMCSF转染72h后的COS细胞检出强烈荧光。ELISA结果显示，质粒表达的融合蛋白均具有SS的免疫学活性，表明融合表达质粒均可在哺乳动物细胞中表达具有生长抑素免疫学活性的融合蛋白，而表达水平pEGS／2SS＜pES／2SS＜pEGS／2SS-GMCSF＜pES／2SS-GMCSF，提示pEGS／2SS-GMCSF、pES／2SS-GMCSF可能具有较好的免疫效果。 2 CpGDNA系列佐剂对生长抑素DNA疫苗（pES／2SS）免疫小鼠的免疫增强作用 选择60只20日龄ICI小鼠，雌雄各半，分为6组，分别用CpG-ODN（单链CpG）、pE-CDG质粒、E.coli DNA（细菌DNA）、脂质体粗品等佐剂联合生长抑素质粒pES／2SS进行免疫。疫苗剂量为20μg／只，佐剂按等量与之混合。初次免疫2周后以相同剂量

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 生长抑素在动物生产中的作用及其免疫调控
• 1 生长抑素
• 1.1 生长抑素的生物学特性及其生理作用
• 1.1.1 生长抑素的分子结构
• 1.1.2 生长抑素的分布及其生理作用
• 1.2 生长抑素受体
• 1.3 生长抑素体内作用机制
• 2 生长激素分泌的神经内分泌调节
• 3 激素免疫调控研究的概述
• 3.1 生长激素轴的免疫调控
• 3.2 GRF的免疫调控
• 3.3 类胰岛素生长因子作用的调节
• 3.4 动物生长抑素的调控研究
• 3.4.1 生长抑素主动免疫
• 3.4.1.1 生长抑素合成肽疫苗促生长的研究
• 3.4.1.2 生长抑素基因工程苗促生长的研究
• 3.4.1.3 SS痘苗病毒活载体苗的研究
• 3.4.2 生长抑素被动免疫
• 第二章.生长抑素基因免疫技术和分子佐剂研究进展
• 1 生长抑素基因疫苗的构建
• 1.1 生长抑素抗原基因的优化和免疫增强基因的选择
• 1.2 真核表达载体的选择
• 1.3 生长抑素基因疫苗的表达鉴定
• 1.4 生长抑素基因疫苗pES／2SS的构建
• 2.分子佐剂研究进展
• 2.1.CpG免疫刺激寡核苷酸序列
• 2.2 细胞因子
• 2.3 编码共刺激信号分子的重组质粒
• 2.4.阳离子脂质体
• 2.5 其它佐剂
• 3 提高生长抑素基因免疫效果的主要途径
• 3.1 细胞因子或化学因子的协同
• 3.2 免疫佐剂
• 3.3 DNA疫苗接种方法的选择
• 3.4 改变DNA疫苗的细胞定位
• 3.5 异源初始-加强免疫
• 3.6 母源抗体
• 3.7 多表位基因疫苗
• 4 生长抑素基因免疫对动物生长的作用及其机制
• 4.1 生长抑素基因免疫的作用机制
• 4.2 生长抑素基因免疫
• 5 基因免疫可能存在的问题
• 5.1 DNA疫苗安全性问题
• 5.2 关于免疫效果相差较大的问题
• 5.3 关于启动子的选择问题
• 5.4 关于蛋白质、内毒素的污染问题
• 6 生长抑素基因疫苗免疫的可行性和应用前景
• 6.1 生长抑素基因疫苗免疫的可行性
• 6.2 生长抑素基因疫苗在生产使用上的优势
• 6.2.1 基因免疫的优越性
• 6.2.2 湖羊生产面临的问题
• 7 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第三章 生长抑素DNA疫苗质粒和基因佐剂质粒的构建及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒、细菌和细胞
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 主要试剂与工具酶
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒小量培养与抽提纯化
• 1.2.2 质粒浓缩
• 1.2.3 胶回收DNA
• 1.2.4 融合基因表达产物的结构与理化特性预测
• 1.2.5 融合基因表达质粒的构建
• 1.2.6 融合基因表达质粒的酶切和测序鉴定
• 1.2.7 融合表达质粒PES／2SS-GMCSF在COS细胞中的表达
• 2 结果
• 2.1 生长抑素融合基因S／2SS和S／2SS-GMCSF表达产物的结构与理化特性
• 2.2 融合表达质粒pES／2SS、pEGS／2SS的鉴定
• 2.3 构建pES／2SS-GMCSF过程中的酶切、测序鉴定
• 2.4 构建pE-GMCSF过程中的酶切、测序鉴定
• 2.5 构建pE-CpG过程中的酶切、测序鉴定
• 2.6 DNA体外转染COS7细胞
• 3 讨论
• 3.1 生长抑素融合蛋白的抗原性
• 3.2 CpG免疫刺激序列对DNA疫苗的免疫增强作用
• 3.3 GM-CSF免疫佐剂克服DNA疫苗免疫原性差的作用
• 3.4 生长抑素基因疫苗和基因佐剂质粒的构建及表达
• 4 参考文献
• 第四章 CpGDNA增强生长抑素DNA疫苗pES／2SS免疫小鼠特异性免疫应答的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 质粒及佐剂的制备
• 1.4 实验方案
• 1.5 免疫应答检测
• 1.6 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 生长抑素DNA疫苗和基因佐剂提取结果
• 2.2 免疫诱导的淋巴细胞增殖反应
• 2.3 生长抑素质粒（pES／2SS）免疫小鼠对抗体产生的影响
• 2.4 抗体分型检测
• 2.5 脾脏TH1／TH2细胞因子的表达
• 3 讨论
• 3.1 生长抑素表达质粒的免疫原性及其免疫作用机制
• 3.2 CpG序列增强DNA疫苗的免疫效果
• 1型免疫佐剂效应'>3.3 CpGDNA诱导产生TH₁型免疫佐剂效应
• 3.3 加强免疫对免疫效果的影响
• 3.4 进一步提高生长抑素基因免疫反应性的途径
• 4 参考文献
• 第五章 CpGDNA对生长抑素基因疫苗pES／2SS免疫小鼠生长及GH和IGF-Ⅰ的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA疫苗及CpGDNA制备
• 1.3 动物免疫接种
• 1.4 血样采集及称重
• 1.5 激素测定
• 1.6 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 各组小鼠在处理后不同时期的增重
• 2.2 生长抑素质粒pES／2SS免疫对GH的影响
• 2.3 生长抑素基因免疫对IGF-1的影响
• 2.4 生长与抗生长抑素抗体、GH、IGF水平相关分析
• 3 讨论
• 3.1 生长抑素基因免疫对小鼠生长的影响
• 3.2 生长抑素基因免疫对GH和IGF-1的影响
• 4 参考文献
• 第六章 分子佐剂对生长抑素基因免疫湖羊羔羊的促生长作用及机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 质粒的大量培养与抽提纯化
• 1.4 细菌DNA的提取
• 1.5 质粒的浓缩与稀释
• 1.6 实验动物与免疫、采血、称重
• 1.7 生长抑素抗体的检测
• 1.8 激素检测
• 1.9 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 生长抑素DNA疫苗和基因佐剂的制备
• 2.2 生长抑素质粒免疫湖羊对抗体产生的影响
• 2.3 各组羔羊增重
• 2.4 血中GH水平
• 2.5 生长与抗生长抑素抗体、GH、IGF水平相关分析
• 3.讨论
• 3.1 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊免疫应答的影响
• 3.2 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊生长的影响
• 3.3 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊外周血中GH和IGF-Ⅰ的影响
• 3.4 免疫程序的制定
• 4 参考文献
• 第七章 生长抑素DNA疫苗免疫湖羊羔羊的安全性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 DNA抽提、纯化、鉴定结果
• 2.2 pES／2SS和pES／2SS-GMCSF质粒（阳性对照）的PCR扩增结果
• 2.3 试验样品染色体基因组的PCR扩增结果
• 3.讨论
• 4 参考文献
• 全文讨论
• 全文结论
• 创新
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢