离子液体中脂肪酶催化酯交换合成和拆分的研究

论文摘要

离子液体具有热稳定性高、蒸汽压低、对环境友好等特点而被研究者称为“绿色”溶剂，同时离子液体强极性的特点也拓宽了酶催化反应介质选择的范围。本论文以三种常用于生物催化的脂肪酶作催化用酶，在“绿色”反应介质—离子液体中实现了香料（乙酸香叶酯）的合成和手性对映体（薄荷醇、烯丙酮醇）的拆分，同时也对酶在离子液体中催化所存在的问题进行了一些探讨。以水溶性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[BMIM][BF4]]）为目标产物，研究了超声合成离子液体的方法。发现通过控制超声处理条件（740 W～760 W，工作时间4秒，间歇时间5秒）和选择适宜超声对象（甲基咪唑和溴代正丁烷）仅用1h左右就能得到反应中间产物1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[BMIM][Br]）。同时还采用超声处理一锅煮的方法合成了离子液体[BMIM][BF4]，水浴温度控制80℃左右超声处理1h左右就能以较高的得率（＞50％）得到产物。以固定化的南极假丝酵母脂肪酶（Candida antarctica lipase B）为催化用酶催化香叶醇和乙酸乙烯酯在离子液体中的酯交换反应，合成了香料乙酸香叶酯，同时通过该反应了解了酶和离子液体的重复利用性。结果发现较优的催化反应条件为：水活度为0.28，底物酯和醇物质量比为9.42，30℃。很难通过过滤来达到离子液体与固定化酶的分离，而连续化的批次反应是一种能重复利用离子液体和酶的手段。在优化后的反应条件下重复利用12次后，离子液体体积和酶的催化活性都没有明显减少。以柱状假丝酵母脂肪酶（Candida cylindracea lipase）为催化用酶催化了薄荷醇在离子液体中的拆分，并通过该拆分反应对提高酶在离子液体中催化选择性的一些方法和手段进行了探讨。结果发现，适量的丙酸酐浓度（丙酸酐和薄荷醇物质量比为1：1）、合适的酶量(100 U·ml-1)和较低的水活度（水活度小于0.63）有助于提高催化反应的选择性，改善酶在离子液体中对薄荷醇的拆分效果。以洋葱假单胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacia lipase）为催化用酶，实现了外消旋烯丙酮醇在离子液体中的拆分，同时通过该拆分反应了解不同方法（共沉淀、冻干、包被微晶体酶的制备）制备所得到的各种形式的酶在离子液体中的催化效果。首先对商品酶在离子液体中催化拆分的反应条件进行了优化，并以酶在乙酸乙烯酯中的催化作为对照进行了对比。结果表明在离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIM][PF6]）中脂肪酶具有较高的初始反应速率和热稳定性能，优化的反应条件为：水活度为0.17，温度为40℃，pH7。研究了不同形式的酶在离子液体中对烯丙酮醇的拆分效果，并以商品酶在离子液体中对烯丙酮醇的拆分作对照进行了比较。结果发现以失水山梨醇单硬脂酸酯（Span 60）、硬脂酸与酶共沉淀所得到的酶和以β-环糊精（β-cycodextrin）为材料通过两种不同方法（包被微晶体酶的制备和冻干法）制得的酶，在离子液体中催化反应时反应的转化率有明显提高。进一步研究了脂肪酶与不同环糊精冻干后所得冻干酶在离子液体中的催化效果，发现所选用的环糊精和溶剂共同决定了酶催化反应的E值和反应的转化率，当拆分反应在离子液体[BMIM][PF6]中进行时，以羟基-β-环糊精为材料制得的冻干酶能取得较好的催化效果。随着冻干时所加入环糊精的量增加，所得冻干酶催化反应的初始速率急剧增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 非水相酶催化进展
• 1.1.1 非水相介质和非水相反应体系
• 1.1.1.1 非水相介质
• 1.1.1.2 非水相反应体系
• 1.1.2 不同因素对非水相酶催化的影响
• 1.1.2.1 冻干保护剂对酶构象的影响
• 1.1.2.2 水对非水相酶催化的影响
• 1.1.2.3 反应介质对非水相酶催化的影响
• 1.1.2.4 载体对非水相酶催化的影响
• 1.1.3 非水相酶催化反应中酶活性和催化选择性的调控
• 1.1.3.1 通过酶工程方法调控
• 1.1.3.2 通过底物工程方法调控
• 1.1.3.3 通过介质工程方法调控
• 1.1.3.4 通过其它手段调控
• 1.2 离子液体中酶催化研究进展
• 1.2.1 离子液体的结构及分类
• 1.2.2 离子液体的特性
• 1.2.3 离子液体的纯化与回收
• 1.2.4 酶在离子液体中催化
• 1.2.4.1 离子液体对酶催化性质的影响
• 1.2.4.2 离子液体中水活的控制对酶催化的影响
• 1.2.4.3 不同形式的酶在离子液体中的催化效果
• 1.3 本论文的研究思路及内容
• 第二章 超声辅助合成离子液体
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 方法
• 4]的检测'>2.2.2.1 [BMIM][BF₄]的检测
• 4]'>2.2.2.2 超声两步合成法合成[BMIM][BF₄]
• 4]'>2.2.2.3 超声一锅煮法合成[BMIM][BF₄]
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 合成产物的鉴定
• 4]'>2.3.2 超声两步合成法合成[BMIM][BF₄]
• 4]'>2.3.3 超声一锅煮法合成[BMIM][BF₄]
• 2.4 小结
• 第三章 Candida antarctica lipase B在离子液体中催化乙酸香叶酯的合成
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 实验材料和仪器
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 水活度的控制
• 3.2.2.2 酶初始反应速率测定
• 3.2.2.3 不同底物摩尔比的酶催化反应
• 3.2.2.4 批次反应条件
• 3.2.2.5 GC检测方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶在离子液体中水活控制及催化
• 3.3.2 不同底物摩尔比的催化得率
• 3.3.3 不同温度对反应进程的影响
• 3.3.4 离子液体及酶的重复利用
• 3.4 小结
• 第四章 Candida cylindracea lipase在离子液体中的催化薄荷醇的拆分
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 实验材料和仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 水活的控制
• 4.2.2.2 同工酶的分离和制备
• 4.2.2.3 酶蛋白含量测定
• 4.2.2.4 酶催化反应
• 4.2.2.5 GC检测方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 不同酰基供体对薄荷醇拆分反应的影响
• 4.3.2 非酶促反应的反应进程
• 4.3.3 酸酐浓度对薄荷醇拆分反应的影响
• 4.3.4 加碱对薄荷醇拆分反应的影响
• 4.3.5 酶量对薄荷醇拆分反应的影响
• 4.3.6 不同水活条件下酶的催化选择性
• 4.3.7 不同同工酶在离子液体中的催化选择性
• 4.4 小结
• 第五章 Pseudomonas cepacia lipase在离子液体中催化烯丙酮醇拆分
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料和方法
• 5.2.1 实验材料及仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 水活度控制
• 5.2.2.2 pH控制
• 5.2.2.3 酶活性测定
• 5.2.2.4 动力学参数拟合
• 5.2.2.5 酶热稳定性测定
• 5.2.2.6 GC分析及检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 酶在离子液体中拆分反应的动力学模型
• 5.3.1.1 不同酶量下的初始反应速率
• 5.3.1.2 不同摇床转速下的初始反应速率
• 5.3.1.3 动力学模型推导
• 5.3.1.4 两种不同动力学模型的拟合及比较
• 5.3.2 酶在离子液体中催化烯丙酮醇的拆分
• 5.3.2.1 不同介质对酶性质和对拆分反应的影响
• 5.3.2.2 水活度对酶活性的影响
• 5.3.2.3 温度对消旋烯丙酮醇拆分的影响
• 5.3.2.4 pH对消旋烯丙酮醇拆分的影响
• 5.3.2.5 共溶剂对消旋烯丙酮醇拆分的影响
• 5.4 小结
• 第六章 Pseudomonas cepacia lipase不同酶形式在离子液体中的催化
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料和方法
• 6.2.1 实验材料及仪器
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.2.1 加入脂肪酸和表面活性剂和酶共沉淀
• 6.2.2.2 加入冻干保护剂或赋形剂和酶冻干
• 6.2.2.3 包被微晶体酶的制备
• 6.2.2.4 蛋白含量测定
• 6.2.2.5 酶催化反应
• 6.2.2.6 GC分析与检测
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 共沉淀处理后酶的催化效果
• 6.3.1.1 表面活性剂及类似物对酶催化反应的影响
• 6.3.1.2 共沉淀处理过后酶催化的适宜温度
• 6.3.2 冻干酶的催化
• 6.3.3 包被微晶体酶的催化
• 6.3.4 冻干酶和包被微晶体酶催化反应的对比
• 6.4 小结
• 第七章 Pseudomonas cepacia lipase与环糊精冻干后在离子液体中的催化
• 7.1 前言
• 7.2 实验材料和方法
• 7.2.1 实验材料及仪器
• 7.2.2 实验方法
• 7.2.2.1 冻干酶的制备
• 7.2.2.2 冻干酶pH的控制
• 7.2.2.3 酶催化反应
• 7.2.2.4 酶热稳定性
• 7.2.2.5 GC分析和检测
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 不同类型的环糊精对催化的影响
• 7.3.2 环糊精加入量对催化的影响
• 7.3.3 pH对冻干酶活性的影响
• 7.3.4 温度对冻干酶活性及稳定性的影响
• 7.4 小结
• 第八章 结论与建议
• 8.1 结论
• 8.2 建议
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢