悬铃木叶片体外植株再生系统及四倍体的诱导和转反义LFY基因研究

论文摘要

悬铃木树干高大,绿化效果好,叶片吸尘、杀菌,抗有毒气体和病虫害能力强,是世界著名的行道树,有“行道树之王”的美誉,因此,我国许多城市都有种植。但其果毛不仅污染环境,而且会引发呼吸系统及皮肤疾病,给居民的生活带来了极大的不便。为此,国内外学者曾进行了大量的研究工作,以期解决果毛污染问题。随着科学技术的发展,细胞工程和基因工程为解决这些问题提供了新的途径。本试验首先利用细胞全能性原理诱导出了悬铃木四倍体植株,然后研究了影响根癌农杆菌转化悬铃木的多种因素,优化了转化条件,建立了悬铃木遗传转化系统;筛选出了适宜悬铃木组培苗叶片DNA的提取方法;利用GUS报告基因和PCR技术检测了转基因植株。实验结果如下:1在含不同浓度秋水仙素的MS+0.1 mg/L NAA+15 mg/L BA双层培养基上进行悬铃木幼苗叶片细胞染色体加倍诱导试验,并通过变异植株根尖细胞染色体观察和叶片单细胞DNA含量测定进行倍性分析.结果表明,预培养12d的悬铃木叶片在秋水仙素浓度为10 mg/L的双层培养基上预培养处理24h时,四倍体诱导率最高达到23.4%.变异植株叶片比二倍体大,叶片长宽比变小,叶片单个气孔变大,气孔密度变小.2表达载体pBI121中整合了反义LEAFY基因,在反义LEAFY基因上有一HindIII酶切位点。通过碱裂解法提取质粒DNA,用HindIII和EcoRI对其进行酶切,切出了预期大小的DNA片段。将此质粒用冻融法导入根癌农杆菌LBA4404。PCR扩增显示反义LEAFY基因转入农杆菌中。3在幼芽生根和叶片分化培养基中分别加入质量浓度为15 mg·L-1和40 mg·L-1Ka,根和叶片愈伤组织、幼芽的诱导率均为0;在分化和生根培养基中分别加入质量浓度为500 mg·L-1和800 mg·L-1的Cef则可使愈伤组织、幼芽和根的诱导率为0。在叶片分化培养基中同时加入这2种抗生素,愈伤组织和幼芽诱导率为0的Ka+Cef组合的质量浓度为30 + 400 mg·L-1。4预培养9 d的悬铃木叶片在OD600值为0.7的根癌农杆菌菌液中浸染10 min后,再在含有100μmol·L-1的乙酰丁香酮的共培养培养基上黑暗条件下共培养3 d叶片的遗传转化效率最高。该体系的建立为进行农杆菌介导外源目的基因培养悬铃木新品种奠定了基础。5在DTT、PVP和AC 3种物质中以0.08 mg·L-1的DTT抑制褐化最有效,褐化率为19%;质量分数为0.1%的AC次之,褐化率为27%;质量浓度为2 000 mg·L-1的PVP褐化率最高为48%。其它因素中,以10℃、光照强度为2 500 lx条件下褐化率达12%,效果最理想。6在SDS-Ⅰ、SDS-Ⅱ、CTAB-Ⅰ和CTAB-Ⅱ提取叶片DNA的4种方法中,CTAB-Ⅱ法为DNA提取的最佳方法。7含一定浓度Ka的选择培养基对悬铃木外植体进行再生培养筛选,淘汰部分不具备Ka抗性的白化外植体。对筛选出的再生植株通过组织化学染色法检测GUS活性,结果在转基因植株的组织中检测到蓝色。PCR特异扩增的分子生物学检测结果也表明外源目的基因反义LEAFY整合入了悬铃木基因组中。本试验获得了一批转基因悬铃木植株,这为后期在生产水平上选育出无球果的转基因悬铃木品种奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 转基因林木的主要研究领域
• 1.1.1 抗病虫品种的培育
• 1.1.2 改变林木的材（品）质
• 1.1.3 抗除草剂林木的研究
• 1.1.4 抗逆境品种的培育
• 1.1.5 木本植物的基因转化系统
• 1.2 转基因木本植物的鉴定
• 1.2.1 报告基因的酶法检测
• 1.2.2 PCR 检测
• 1.2.3 Southern 检测
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 悬铃木体细胞胚胎发生植株再生
• 2.2.2 悬铃木器官发生植株再生
• 2.3 悬铃木四倍体诱导研究
• 2.3.1 悬铃木无菌种子的获得
• 2.3.2 悬铃木染色体的诱导处理
• 2.3.3 变异植株染色体的鉴定
• 2.3.4 成活率和诱导率的计算
• 2.3.5 四倍体生理指标、DNA 含量测定和克隆技术的研究
• 2.4 悬铃木遗传转化
• 2.4.1 抗生素对悬铃木叶片植株再生的影响
• 2.4.2 悬铃木转化体系
• 2.4.3 悬铃木遗传转化中外植体褐化问题试验
• 2.4.4 转化植株的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 悬铃木体外植株再生系统的建立
• 3.1.1 悬铃木体细胞胚胎发生植株再生
• 3.1.2 悬铃木叶片器官发生植株再生
• 3.2 悬铃木四倍体离体诱导
• 3.2.1 秋水仙素液体浸泡诱导悬铃木染色体变异
• 3.2.2 秋水仙素加入固体培养基诱导悬铃木染色体变异
• 3.2.3 染色体的变异鉴定
• 3.2.4 四倍体叶片在不同培养基上愈伤组织诱导
• 3.2.5 四倍体叶片在不同激素浓度组合的WPM 培养基上愈伤组织诱导
• 3.2.6 四倍体叶片愈伤组织在不同激素浓度组合的WPM 培养基上芽的分化
• 3.2.7 四倍体芽的根分化
• 3.3 悬铃木遗传转化
• 3.3.1 抗生素对悬铃木叶片愈伤组织及其芽诱导的影响
• 3.3.2 悬铃木转化体系
• 3.3.3 根癌农杆菌介导悬铃木遗传转化体系的建立
• 4 结论
• 主要参考文献
• Abstract