龙血树钙依赖型蛋白激酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

血竭具有活血化瘀、止血、抗肿瘤等多种药理作用,在临床上被用于治疗多种疾病。目前血竭的生产主要是从龙血树中提炼而成。随着对血竭需求量的增加,龙血树被过度采伐,使其自然资源急剧减少,这将限制了血竭的生产。因此,阐明血竭形成的机理,为提高龙血树血竭的含量和发现新的生产途径提供理论依据,是目前研究的一个重要方向。在前期工作中,我们已经通过构建龙血树血竭形成相关基因的SSH文库,分离到一批与血竭形成相关的基因片段,其中钙依赖型蛋白激酶基因（CDPK）参与的信号传导途径在血竭形成过程中可能具有重要的作用。本研究通过克隆龙血树CDPK基因并进行其表达分析,为进一步阐明该基因在血竭生物合成途径中的作用提供理论依据。根据已知SSH片段设计引物,利用RT-PCR技术并结合RACE策略,首次从龙血树中获得了一个CDPK基因,将其命名为DrCDPK。该基因具有完整的开放阅读框架,其编码的氨基酸序列具有已报道的CDPKs的所有典型结构特征。经序列比对发现,此蛋白质序列与其它植物中的CDPKs具有40-55%的同源性。另外,我们对DrCDPK基因进行RT-PCR表达分析,结果显示,DrCDPK基因受诱导物诱导后,表达明显增强,这说明DrCDPK基因在形成血竭的组织中差异表达,此为进一步研究打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 龙血树
• 1.1.1 龙血树属植物血竭的化学成分研究
• 1.1.1.1 类黄酮化合物
• 1.1.1.2 酚类成分
• 1.1.1.3 甾体及甾体皂苷类成分
• 1.1.1.4 其它成分
• 1.1.2 龙血树血竭药理作用
• 1.1.2.1 活血化瘀作用
• 1.1.2.2 止血作用
• 1.1.2.3 抗肿瘤作用
• 1.1.2.4 消炎镇痛
• 1.1.3 血竭的临床应用
• 1.1.3.1 冠心病
• 1.1.3.2 糖尿病
• 1.1.3.3 妇科疾病
• 1.1.3.4 上消化道出血
• 1.1.3.5 胃炎和消化性溃疡
• 1.1.3.6 软组织损伤及骨关节损伤
• 1.1.3.7 痔疮
• 1.1.4 龙血树血竭形成机理的研究
• 1.2 钙依赖型蛋白激酶的研究现状
• 1.2.1 CDPKs 的一般理化性质
• 1.2.2 CDPKs 的结构
• 1.2.3 CDPKs 的底物
• 1.2.4 CDPKs 在植物中的生理作用
• 1.2.4.1 调节非生物胁迫信号转导途径
• 1.2.4.2 调节激素反应
• 1.2.4.3 调节病原菌防卫反应
• 1.2.4.4 调节植物的营养代谢
• 1.2.4.5 在植物生长发育过程中的作用
• 1.2.4.6 参与离子和水分的跨膜运输
• 1.2.4.7 参与植物细胞骨架的调节
• 1.2.4.8 调节气孔运动
• 1.2.5 CDPKs 的活性调节
• 2+浓度的调节'>1.2.5.1 Ca²⁺浓度的调节
• 1.2.5.2 磷酸化的调节
• 1.2.5.3 磷脂的调节
• 1.2.5.4 14-3-3 蛋白的调节
• 1.2.5.5 CDPKs 的豆蔻酰化和棕榈酰化
• 1.2.5.6 CaM 的拮抗剂的调节
• 1.2.6 调节 CDPK 基因表达的外界因素
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 龙血树 Total RNA 的提取
• 2.2.3 RNA 电泳检测
• 2.2.4 3`RACE 反应体系和反应程序
• 2.2.4.1 反转录反应
• 2.2.4.2 RT-PCR 反应
• 2.2.4.3 电泳
• 2.2.5 5`RACE 反应体系和反应程序
• 2.2.5.1 cDNA 第一链的合成
• 2.2.5.2 cDNA 的纯化
• 2.2.5.3 加尾反应体系
• 2.2.5.4 RT-PCR 反应
• 2.2.6 目的片段的回收与测序
• 2.2.6.1 回收目的片段
• 2.2.6.2 目的片段与T 载体的连接
• 2.2.6.3 大肠杆菌感受态受体菌的制备
• 2.2.6.4 连接产物转化大肠杆菌
• 2.2.6.5 重组质粒 DNA 的小量提取
• 2.2.6.6 重组子的筛选及鉴定
• 2.2.6.7 重组子阳性克隆菌的保存
• 2.2.7 核酸序列分析
• 2.2.7.1 cDNA 序列的获得
• 2.2.7.2 cDNA 序列开放阅读框分析
• 2.2.7.3 基于 Blastx 软件的核酸同源性分析
• 2.2.7.4 蛋白质功能预测
• 2.2.7.5 蛋白质的结构功能域分析
• 2.2.7.4 基于 Blastx 软件的蛋白质同源性分析
• 2.3 基因表达特征分析
• 2.3.1 RNA 提取
• 2.3.2 cDNA 的合成（方法同2.2.4.）
• 2.3.3 引物设计与合成
• 2.3.4 半定量 RT-PCR 模板量的确定
• 2.3.5 RT-PCR 反应体系和条件
• 2.3.6 凝胶电泳图像的数字化分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 龙血树TOTAL RNA 的提取
• 3.2 3' RACE 及序列分析
• 3.3 5' RACE 及序列分析
• 3.4 全长CDNA 的阅读框架分析
• 3.5 核酸同源序列分析
• 3.6 蛋白质的结构功能域分析
• 3.7 蛋白质同源性分析
• 3.8 CDPK 基因的表达分析
• 3.8.1 龙血树 Total RNA 的提取
• 3.8.2 经诱导和未经诱导的表达差异
• 4.讨论
• 4.1 关于RACE 技术应该注意的一些事项
• 4.2 下一步研究的方向
• 5. 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢