运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建及大肠杆菌K-12 talB基因的表达

论文摘要

运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌,微好氧生长。Z.mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。Z.mobilis可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖,利用基因工程手段改造Z.mobilis,拓宽其可利用碳源的范围,是当前Z.mobilis基因工程改造工作的首要任务之一。基因工程改造首先需要有好的载体系统。本研究以Z.mobilis ATCC10988中内源质粒pZM2（2749bp）和E.coli中的质粒pBR328（4907bp）、pACYC184（4245bp）为出发质粒,构建Z.mobilis-E.coli之间的克隆型穿梭质粒。首先分别制备含pZM2的复制区和分配区的DNA片段,插入到pBR328的四环素抗性基因中,构建出pZB2（Apr、Cmr,pZM2复制区）和pZB3（Apr、Cmr,pZM2复制区和分配区）;进一步分离pACYC184中的四环素抗性基因DNA片段,分别连接到pZB2和pZB3中,得到pZB21（Apr、Cmr、Tcr,pZM2复制区）和pZB31（Apr、Cmr、Tcr,pZM2复制区和分配区）;然后分别对pZB21、pZB31在E.coli DH5a和Z.mobilis CP4中的稳定性、拷贝数进行了比较分析,结果是:pZB21、pZB31都优于实验室先前构建的pZB1,而pZB31又优于pZB21,故选定pZB31作为穿梭载体。最后,以pZB31为载体,在Z.mobilis CP4中表达E.coli K-12的talB基因,酶活水平达0.051 U/mg蛋白,高于以pZB1为载体的相同基因的表达水平（为0.035 U/mg蛋白）。通过以上工作,构建得到了一个能满足使用要求的、较为理想的Z.mobilis-E.coli之间的穿梭载体即pZB31,其具有与pBR328完全相同的抗性标记。

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 Z．mobilis 概述
• 1.2 Z．mobilis 内源质粒研究
• 1.3 关于ATCC10988 中pZM2 质粒的研究
• 1.4 Z．mobilis 载体系统的构建与研究
• 1.5 Z．mobilis CP4 的研究进展
• 1.6 课题的研究目的、背景和内容
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究背景
• 1.6.3 研究内容
• 1.7 实验流程
• 1.7.1 实验流程图
• 1.7.2 穿梭质粒构建示意图
• 第二章 试验材料和方法
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 培养基和常用溶液的配制方法
• 2.1.4 蛋白质含量测定试剂
• 2.1.5 转醛醇酶酶活测定试剂
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 菌体培养
• 2.2.2 质粒的提取
• 2.2.3 PCR扩增目的基因
• 2.2.4 酶切反应
• 2.2.5 电泳分析与分离
• 2.2.6 电泳条带的回收
• 2.2.7 乙醇沉淀纯化回收DNA片段
• 2.2.8 连接反应
• 2.2.9 E．coli 一步法感受态细胞制备与转化、阳性转化子筛选
• 2.2.10 质粒电穿孔转化Z．mobilis CP4 和转化子的筛选
• 2.2.11 质粒的稳定性检测
• 2.2.12 质粒的拷贝数测定
• 2.2.13 E．coli K-12 talB蛋白质浓度和酶活性检测
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 pZB2 的构建
• 3.1.1 连接与转化
• 3.1.2 转化子质粒酶切分析鉴定
• 3.2 pZB3 的构建
• 3.2.1 pZB2/NheI+BamHI 双酶酶切片段的制备
• 3.2.2 PCR克隆pZM2 的分配区片段
• 3.2.3 pZB3 的构建
• 3.3 pZB21 的构建与转化Z．mobilis CP4
• 3.3.1 连接与转化
• 3.3.2 转化子质粒提取物的酶切分析鉴定
• 3.3.3 pZB21 电穿孔法转化CP4 与转化子的筛选与鉴定
• 3.4 pZB31 的构建与转化Z．mobilis CP4
• 3.4.1 连接与转化
• 3.4.2 转化子质粒提取物的酶切分析鉴定
• 3.4.3 pZB31 电穿孔法转化CP4 与转化子的筛选与鉴定
• 3.5 pZB21、pZB31 的稳定性和拷贝数初步比较
• 3.5.1 稳定性比较
• 3.5.2 拷贝数比较
• 3.6 E．coli K-12 talB 在Z．mobilis CP4 中的表达
• 3.6.1 pZB31-talB的构建
• 3.6.2 酶活测定
• 第四章 结论
• 4.1 结论
• 4.2 建议
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录
• 一、pZM2 物理图谱
• 二、pBR328 物理图谱
• 三、pZB1 物理图谱
• 四、pACYC184 物理图谱
• 五、pZB2 物理图谱
• 六、pZB21 物理图谱
• 七、pZB3 物理图谱
• 八、pZB31 物理图谱
• 九、pZB1-talB 物理图谱
• 十、pZB31-talB 物理图谱
• 十一、测序结果
• 致谢