论文摘要
引言既往研究表明蜂胶黄酮具有确切的抗动脉粥样硬化功能，其作用机制也有较为详细的研究,但仍不明确。已知CD4+CD25+调节性T细胞对动脉粥样硬化具有抑制作用，蜂胶黄酮是否通过影响CD4+CD25+调节性T细胞的数量和/或功能从而发挥抗动脉粥样硬化的作用，目前尚未见报道。本研究通过实验动物模型探讨蜂胶黄酮对CD4+CD25+调节性T细胞及动脉粥样硬化的影响。目的1.探讨验证蜂胶黄酮与血脂、NO、NOS、ET、VEGF等指标的关系；2.进一步验证蜂胶黄酮的抗动脉粥样硬化作用；3.明确蜂胶黄酮是否通过影响CD4+CD25+调节性T细胞的数量和/或功能，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。方法用超声波辅助乙醇提取法提取蜂胶黄酮，采用硅胶柱层析纯化蜂胶总黄酮，分光光度计法鉴定蜂胶黄酮纯度。利用7-8周龄雄性ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬模型，随机分为4组，每组10只。分别为：1.高脂组（HL组）:高脂饲料饲养；2.正常对照组（NC组）：普通饲料饲养；3.高脂+蜂胶黄酮组（HP）：高脂饲料饲养并且给予蜂胶黄酮300mg.kg-1.d-1；4.蜂胶黄酮组（PF组）：普通饲料饲养并给予蜂胶黄酮300mg.kg-1.d-1。连续灌胃给药14周，内眦静脉取血，离心获得血清，然后采用生化分析仪检测其中甘油三脂（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）浓度；硝酸还原酶法检测血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）浓度；酶联免疫双抗体夹心法（ELISA）检测血清内皮素（ET）和血管内皮生长因子（VEGF）浓度；取小鼠整条动脉，进行油红O染色分析整条主动脉AS斑块面积占整条主动脉面积的比例；取小鼠脾脏研磨、过滤获得脾细胞后进行原代细胞培养，培养24小时后进行流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞比例；从小鼠脾脏细胞提取mRNA以RT-PCR法检测Foxp3mRNA表达。结果（1）血液TG浓度HL组、HP组、NC组和PF组依次降低，分别是：HL组16.04±1.41mmol/L，HP组13.97±1.34mmol/L、NC组10.00±1.51mmol/L，PF组6.92±1.04mmol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组TG浓度显著高于PF组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。同样，血液LDL浓度HL组、HP组、NC组和PF组亦逐渐降低，，分别是：HL组11.05±1.81mmol/L，HP组8.82±0.91mmol/L，NC组7.38±1.04mmol/L，PF组6.16±0.96mmol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组LDL浓度显著高于PF组，差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）PF组、NC组、HP组、HL组血清NO浓度依次降低，分别为87.40±6.56umol/L、80.38±6.75umol/L、80.18±7.13umol/L、71.6±6.13umol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组TG浓度显著低于PF组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。（3）PF组血清TNOS浓度（20.14±5.99U/mL）显著低于HL组（45.48±7.38U/mL）、HP组（40.32±5.91U/mL）、NC组（36.70±5.70U/mL），差异有统计学意义（P均<0.05）。PF组血清iNOS浓度（15.06±3.34U/mL）显著低于HL组（39.11±5.25）、HP组（34.49±2.80U/mL）和NC组（31.66±2.73U/mL），方差分析表明差异均有统计学意义（P均<0.05）。HL组血清TNOS、iNOS水平均显著高于NC组，差异均有统计学意义（P<0.05），HP组与NC组间血清TNOS、iNOS差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）方差分析表明，PF组血清ET浓度显著低于HL组（57.04±6.20ng/Lvs82.19±6.85ng/L），NC组（73.42±6.21ng/L）和HP组（78.42±5.81ng/L），差异有统计学意义（P<0.05）。HP组和NC组血清ET差异无统计学意义（P>0.05）。NC组低于HL组，差异有统计学意义（P<0.05）。（5）PF组动脉粥样硬化面积/整条动脉面积显著低于HL组（0.20±0.06ratiovs0.44±0.05ratio），也显著低于PF组（0.38±0.06ratio）和NC组（0.35±0.07ratio）差异有统计学意义（P<0.05）；HP组和NC组之间差异无统计学意义（P>0.05）；HP组和NC组动脉粥样硬化面积/整条动脉面积显著低于HL组，差异有统计学意义（P<0.05）。（6）PF组血清VEGF浓度显著低于HL组（78.90±13.13ng/Lvs155.62±23.96ng/L），也显著低于NC组（123.28±16.83ng/L）和HP组（135.85±15.65ng/L），方差分析表明，差异有统计学意义（P<0.05）。HL组高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。HP组和NC组血清ET之间差异无统计学意义（P>0.05）。（7）方差分析表明，PF组的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例（5.55±0.77%）显著高于HL组（2.79±0.67%）也高于HP组（4.31±0.69%），差异均有统计学意义（P<0.05）。HP组低于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。PF组和NC组（5.49±0.91%）比较差异无统计学意义（P>0.05）。（8）方差分析表明PF组Foxp3mRNA表达水平显著高于HL组（1.50±0.66copies/ulvs0.77±0.37copies/ul）也高于HP组（1.38±0.23copies/ul）和NC组（1.43±0.13copies/ul），差异有统计学意义（P<0.05）。HP组与NC组之间差异无统计学意义（P>0.05）（详见表12）HL组Foxp3mRNA表达水平低于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论①蜂胶黄酮可以降低ApoE-/-小鼠血清TG、TC、LDL、VLDL浓度；升高小鼠血清NO浓度，降低血清iNOS和ET浓度；②蜂胶黄酮可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展，降低血清中VEGF的水平；③蜂胶黄酮能够提高ApoE-/-小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例和Foxp3mRNA表达水平，提示蜂胶黄酮通过CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞发挥抗动脉粥样硬化作用。
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