抗除草剂基因载体的构建及其水稻转化

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是我国乃至世界上的主要粮食作物。在我国，其栽培总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作物的首位。每年，全国由于杂草危害直接造成的水稻产量损失达一千万吨以上。然而，防除稻田杂草需要投入大量人力、物力和财力，还喷洒大量除草剂，对环境造成严重污染。转基因技术的产生和发展，使我们创造突破性的种质资源成为可能。利用植物基因工程培育抗除草剂优质高产水稻品种，将经济有效的控制稻田杂草，从而推动我国粮食生产。aroA基因所编码的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）提供对除草剂草甘膦的抗性；并且aroA基因所对应的除草剂为高效、低毒、在生物体和土壤中无残留、环保型的除草剂。本研究，将抗除草剂草甘膦的基因aroA构建在植物表达载体上，并通过农杆菌介导法转入水稻不同品种中，获得了抗除草剂的转基因植株，同时对水稻转基因过程中的一些问题作了初步探讨。其主要研究结果如下：1．利用载体pCambia1301和除草剂草甘膦抗性基因基因aroA，构建了一个去除了潮霉素抗性基因hpt的植物表达载体pCambia1301-aroA。2．利用构建的载体，通过根癌农杆菌介导法将aroA基因转入水稻品种，最终共得到16株再生植株。其中其中中花15得到4株，蜀恢527得到12株。3．对16株水稻再生植株进行PCR检测，有9株显示为阳性。其中，蜀恢527有8株，中花15有1株。将PCR检测为阳性的植株，进行田间除草剂抗性检测，结果有2株表现出了除草剂抗性。这一结果说明目的基因不仅整合到水稻基因组中，而且得以充分表达，使水稻植株产生了除草剂抗性。4．对4个材料的成熟胚和幼胚进行愈伤组织的诱导，实验结果表明：不同基因型的水稻出愈率有所不同，其中粳稻出愈率比籼稻高；同一基因的不同材料之间的出愈率也不相同。幼胚诱导出的愈伤质量较好，生长迅速，但是操作较麻烦，而且幼胚的污染率高于成熟胚。5．将不同受体材料的愈伤组织分别接种到含不同浓度草甘膦的培养基上，进行敏感性实验。结果表明，水稻愈伤材料对草甘膦敏感性较差，需使用较高的筛选浓度；同时，粳稻的筛选浓度（最高浓度为1000mg/L）又略高于籼稻（最高浓度为800mg／L）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• Ⅰ 文献综述
• 1 水稻转基因在育种中的应用
• 1.1 抗病害育种
• 1.1.1 抗细菌病害基因工程
• 1.1.2 抗真菌病害基因工程
• 1.1.3 抗病毒病害基因工程
• 1.2 抗虫害育种
• 1.2.1 苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因
• 1.2.2 蛋白酶抑制剂基因
• 1.2.3 植物凝集素基因
• 1.2.4 淀粉酶抑制剂基因
• 1.3 抗逆境育种
• 1.4 品质育种
• 1.5 抗除草剂育种
• 1.5.1 抗EPSPS抑制剂基因及其在水稻上的应用
• 1.5.2 抗ALS抑制剂基因及其应用
• 1.5.3 乙酰CoA转移酶基因及其应用
• 1.5.4 阿特拉津氯水解酶基因及其在水稻上的应用
• 1.5.5 细胞色素P450基因及其在水稻上的应用
• 1.5.6 原卟啉原氧化酶基因及其在水稻上的应用
• 1.6 创造新的不育系、保持系和恢复系
• 1.7 植物生物反应器
• 2 水稻转基因的主要方法及原理
• 2.1 直接转化法
• 2.1.1 基因枪法
• 2.1.2 PEG诱导法
• 2.1.3 电击（激）法
• 2.1.4 花粉管通道法
• 2.1.5 脂质体转化法
• 2.1.6 激光微束介导法
• 2.1.7 低能离子束介导法
• 2.2 间接转化法
• 2.2.1 根癌农杆菌介导转化法
• 2.2.2 其它间接转化方法
• 3.水稻基因工程面临的主要问题和对策
• 3.1 转化率低
• 3.2 转基因沉默
• 3.3 外源基因的低效表达
• 4.转基因的安全性
• 4.1 转基因植物的食品安全性
• 4.2 转基因植物的环境安全性
• 5 抗除草剂转基因水稻的应用前景
• 5.1 作为水稻遗传转化的标记基因
• 5.2 培育具有自主知识产权的抗除草剂水稻品种
• 5.3 解决杂交水稻制种中杂种纯度问题
• 5.4 简化杂交制种程序,降低杂交种成本
• 6.论文立题思想
• Ⅱ 材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 基因,质粒和菌株
• 1.3 细菌培养基的配制
• 1.4 适用于水稻的培养基
• 1.5 质粒DNA提取液:
• 1.6 植物基因组DNA提取用试剂
• 1.7 电泳中用到的溶液
• 2.实验方法
• 2.1.载体构建
• 2.1.1 质粒的少量提取与鉴定（碱裂解法）
• 2.1.2 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（电击法）
• 2.1.3 农杆菌感受态细胞的制备与转化（热激法）
• 2.1.4 限制性内切酶典型的酶切反应:
• 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳的DNA片段的回收
• 2.1.6 T4连接酶典型连接反应
• 2.1.7 去磷酸化反应
• 2.1.8 PCR产物克隆
• 2.1.9 pCAMBIA1301-aroA质粒载体构建方案
• 2.2.受体材料的准备
• 2.2.1 愈伤组织的诱导和继代
• 2.2.2 筛选压的确定
• 2.3.农杆菌介导水稻愈伤组织的转化
• 2.3.1 菌液准备
• 2.3.2 转化
• 2.2.4 洗菌与选择
• 2.3.5 分化与生根
• 2.4.转基因植株的PCR检测
• 2.4.1.植物DNA提取方法
• 2.4.2.转基因水稻植株中aroA基因的PCR检测
• 2.5.转基因植株的田间除草剂抗性检测
• Ⅲ 结果与分析
• 1 载体构建
• 1.1 pCAMBIA1301-aroA质粒载体构建
• 1.2 阳性克隆的筛选及插入方向鉴定
• 1.3 质粒酶切鉴定
• 1.4 质粒PCR验证
• 1.5 测序鉴定
• 2 受体材料的获得
• 2.1 不同外植体愈伤组织的诱导效果
• 2.2 筛选压的确定
• 3 转基因植株的获得
• 3.1 除草荆草甘膦抗性愈伤组织的筛选
• 3.2 转基因水稻植株的再生
• 4.转基因植株的分子鉴定
• 5.转基因植株的田间除草剂抗性鉴定
• Ⅳ 讨论
• 1 水稻遗传转化中草甘膦筛选浓度的确定
• 2 受体材料的选择
• 3 愈伤组织的褐化问题
• 4 继代次数对分化率的影响
• 5 aroA基因作为水稻转化的筛选基因的意义
• 6 后续研究设想
• Ⅴ 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录