茶树离体再生体系与微型嫁接的研究

论文摘要

茶树（Camellia sinensis）是世界上最重要的生产非酒精类饮料的木本植物之一。它生长周期长，自然结实率和杂交结实率都较低，使得常规茶树育种需要20-25年[1]。植物组织培养技术是加快优质品种创新的重要手段，是现代生物技术应用于遗传育种研究的基础。为建立快速、高效的茶树离体再生体系，本研究分别以茶树平阳特早[C. sinensis cv.pingyangtezao]7月下旬枝条和茶树舒茶早[C. sinensis cv. shuchazao]10月中旬的种子子叶为外植体，在离体培养条件下，首先建立了茶树子叶离体再生体系，比较了其器官发生途径和体细胞胚发生途径；其次建立了茶树腋芽离体快繁体系；第三采用微型嫁接的方式，解决了茶树组培苗生根难，耗时长的问题，为茶树组织培养与工业化生产的连接提供技术参考。主要结论如下：1.茶树子叶离体再生的器官发生途径不带胚子叶愈伤组织的诱导率随着2,4-D浓度的升高而增加，细胞分裂素配合生长素使用对愈伤组织的产生有增效作用。在培养基MS+2.0mg L-12,4-D+0.5mg L-1 KT中，岀愈时间最短，岀愈率最高，达83.6%。转到芽诱导培养基MS+2.0mg L-16-BA+0.2mg L-1 NAA中继代培养，带胚子叶的出芽率、芽增殖倍数以及体细胞胚发生率分别为36.5%、12.3和38.2%，均高于不带胚子叶。2.茶树子叶离体再生的体细胞胚发生途径在培养基MS+2.0mg L-16-BA+0.2mg L-1 NAA+1.0mg L-1 GA3中，带胚子叶和不带胚子叶可迅速脱分化产生胚性愈伤组织，进而产生体细胞胚和次级体细胞胚，并萌发出芽。带胚子叶的体细胞胚发生率为85.7%，体细胞胚萌发率79.4%，芽增殖倍数为17.0，均高于不带胚子叶。3.茶树腋芽离体快繁体系的建立以腋芽为外植体，在MS+2.0mg L-16-BA+0.2mg L-1 NAA培养基中腋芽迅速萌发，培养60d，成苗率可达82.3%。将得到的小苗按枝条、去顶芽和部分叶片的枝条、腋芽带茎和部分叶柄三种处理接种于1/2MS+1.0mg L-16-BA+0.1mg L-1 NAA培养基中，腋芽带茎和部分叶柄的处理萌发率和增殖倍数最高，分别达到71.4%和5.5；去顶芽和部分叶片的处理生长的最健壮；整个枝条的处理在部分茎段底端出现体细胞胚。4.胚性愈伤组织的继代培养继代培养中，体细胞胚的发生、萌发以及次级胚性愈伤组织的产生同时进行。胚性愈伤组织的体细胞胚萌发率在M（MS不添加任何激素）培养基中最高，为58.3%，在P(MS+2.0mg L-16-BA+0.2mg L-1N AA+1.0mg L-1 GA3)中最低；而次级体细胞胚发生率以及体细胞胚增殖倍数在后者中最高。5．茶树体细胞胚的发生茶树体细胞胚在子叶柄处直接发生，或在子叶处产生胚性愈伤组织间接发生。带胚子叶以直接和间接两种方式产生体细胞胚，而不带胚子叶只以间接方式产生。在体细胞胚间接发生途径中，子叶表面隆起是发生脱分化的标志，随后细胞团膨大、颜色变绿转化成胚性愈伤组织，其表面长出半透明的颗粒状突起即为体细胞胚。体细胞胚的石蜡切片表明，此处细胞小且排列紧密，细胞质浓，有若干个分生区域，具有分生能力。6．组培苗的微型嫁接选取生长健壮的茶树组培苗，剪取1.5-3cm长作为接穗。茶树种子苗长至一芽二叶，离基部3-5cm剪去嫩梢作为砧木。采用劈接法嫁接，将接穗切口处浸入200mg L-1的2,4-D溶液中3-5min，嫁接于砧木上胚轴处，用石蜡膜固定。20d后成活率为64%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物组织培养概述
• 1.1.1 原理及常用生长调节剂
• 1.1.2 植物组织培养的现状
• 1.1.3 植物组织培养中新技术的应用
• 1.1.3.1 无糖组培技术
• 1.1.3.2 开放组培技术
• 1.1.4 植物组织培养中常见的问题及解决方式
• 1.1.5 植物体细胞胚研究概况
• 1.1.5.1 植物体细胞胚的特点及应用
• 1.1.5.2 植物体细胞胚的发生方式
• 1.1.5.3 植物体细胞胚发生的生化基础
• 1.2 茶树离体再生研究概述
• 1.2.1 茶树器官再生途径的组织培养研究进展
• 1.2.2 茶树体细胞胚再生途径的组织培养研究进展
• 1.2.3 茶树遗传转化研究概况
• 1.3 微型嫁接研究概况
• 1.3.1 微型嫁接的应用
• 1.3.1.1 果树的脱毒
• 1.3.1.2 抗性育种
• 1.3.1.3 快速繁育无毒苗木
• 1.3.1.4 三倍体育种
• 1.3.1.5 果树检疫
• 1.3.1.6 嫁接亲和性鉴定
• 1.3.2 影响微型嫁接成活的因素
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 茶树再生体系的研究
• 2.2.1.1 子叶离体再生体系的研究
• 2.2.1.2 腋芽离体快繁体系的研究
• 2.2.2 茶树体细胞胚的形态及细胞学研究
• 2.2.3 组培苗微型嫁接的研究
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂及配方
• 3.2.2.1 茶树离体培养
• 3.2.2.2 石蜡切片
• 3.3 培养基及培养条件
• 3.4 子叶离体培养
• 3.4.1 外植体的处理
• 3.4.2 器官发生途径的处理
• 3.4.3 体细胞胚发生途径的处理
• 3.4.4 胚性愈伤组织的继代培养
• 3.5 腋芽离体培养
• 3.5.1 外植体的处理
• 3.5.2 腋芽离体培养
• 3.5.3 组培苗继代培养
• 3.6 体细胞胚的形态和细胞学观察
• 3.6.1 体细胞胚形态学观察
• 3.6.2 体细胞胚的细胞学观察
• 3.7 组培苗的微型嫁接
• 3.7.1 接穗和砧木的准备
• 3.7.2 嫁接方法
• 4 结果与分析
• 4.1 子叶离体再生体系的研究
• 4.1.1 子叶离体再生器官发生途径的研究
• 4.1.1.1 激素对不带胚子叶愈伤组织诱导的影响
• 4.1.1.2 再生植株的器官发生途径
• 4.1.2 子叶离体再生体细胞胚发生途径的研究
• 4.1.2.1 体细胞胚产生的方式
• 4.1.2.2 胚性愈伤组织的继代培养
• 4.2 体细胞胚的形态和细胞学研究
• 4.2.1 体细胞胚间接发生途径各阶段的形态特征
• 4.2.2 体细胞胚的细胞学观察
• 4.3 腋芽离体快繁体系的研究
• 4.3.1 腋芽离体培养
• 4.3.2 组培苗的增殖
• 4.4 组培苗的微型嫁接
• 5 讨论
• 5.1 外植体类型对茶树离体再生的影响
• 5.2 茶树离体再生的稳定性
• 5.3 体细胞胚的产生方式
• 5.4 组培苗的增殖
• 5.5 组培苗茎尖枯死的现象
• 5.6 影响微型嫁接的因素
• 5.7 茶树育种展望
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单