论文摘要
多药耐药（Multi-Drug Resistance,MDR）是肿瘤化疗不理想的主要原因之一,而在泌尿系统肿瘤中,肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）又是化疗效果最差的肿瘤之一。众多研究证实,多药耐药现象主要与肿瘤细胞膜上表达的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）相关,该蛋白是ATP能的跨膜蛋白,具有外排泵的功能,从而可以降低细胞内的化学药物浓度。P-gp由MDR-1基因编码,定位于人7q21.1染色体上。自从Juliano等发现了MDR-1基因的表达产物P-gp以来,人们对它的结构、功能及在正常和肿瘤组织的分布进行了研究,发现肾近曲小管、前列腺、肾上腺、胃肠道、胰腺、支气管、乳腺等上皮表面均有P-gp的过量表达。P-gp分子量为170000,是由前后重复的两部分约1280个氨基酸组成的糖蛋白,每一部分均有穿膜疏水区和一个高度保守的ATP结合区,它与细菌的转运蛋白有同源性,表明它有转运功能,可以消耗ATP将进入细胞的化学药物快速泵出细胞,从而明显降低了细胞内的药物浓度,因此,它的高表达导致了肿瘤细胞对化疗药物的耐受性增加。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是一种新兴且日益成熟的的基因沉默技术,目前已被认为是基因工程学领域的一种非常高效的研究工具。用此技术可以高效、稳定、特异地阻止目的基因的表达,从而达到较为理想的沉默效果。目前,dsRNA（double-stranded RNA）,特别是siRNA（small interfering RNA）已被广泛而成功地应用于诸如基因功能研究以及疾病病因与治疗研究等多个领域。在针对原癌基因设计的基因治疗策略中,RNAi基因抑制效果确切,应用微量的siRNA即可使其编码的致病基因产物的含量下降70-90%以上,甚至可以达到基因敲除的效果;其次,RNAi的抑制具有严格的序列特异性,治疗的针对性强,应用此技术能够同时抑制多个不同基因而不致相互干扰;RNAi的作用具有级联放大效应和高穿透性,更适合恶性肿瘤的实验研究。因此,RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景。对多种肿瘤细胞系的研究也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制,化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效的抑制内源性RNA的表达。本研究旨在通过设计能够在肾细胞癌ACHN细胞中稳定高效表达的MDR1-shRNA慢病毒重组载体,研究该重组载体对于肾细胞癌细胞中MDR1基因的干扰效果,并进一步明确干扰前后肾细胞癌细胞对化疗药物敏感性的变化,以期探讨MDR1基因是否可以成为逆转肾细胞癌化疗耐药的有效靶点。第一部分构建RNAi慢病毒载体系统并筛选有效靶点（1）目的基因RNA干扰慢病毒载体制备与病毒滴度标定本实验运用RNA干扰专业设计软件,针对目的基因hMDR1靶基因序列设计三组shRNA干扰靶点序列,分别标记为1#/2#/3#,并构建成为vshRNA重组载体,将连接产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,然后进行测序比对。结果显示,三组shRNA重组载体被成功构建并测序无误。同时,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。（2）RNA干扰有效靶点筛选本研究将三组构建成功的慢病毒重组载体在目的细胞中分别进行转染,转染成功后检验三组重组载体的转染效率,从而从中寻找出最高效的shRNA病毒。方法简介如下:培养生长状态良好的目的细胞,病毒感染前一天将目的细胞分入12-well培养板培养,感染当天按实验设计的分组情况加入不同MOI的RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后在荧光显微镜下观察GFP表达情况,5天后收集细胞,采用RealtimePCR的方法检测目的基因mRNA的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。通过荧光图片可知目的细胞的病毒感染效率达到90%以上。三个靶点中,3#靶点是RNAi的有效靶点。相对NC组,目的基因的表达水平下调约40%。比较高低MOI的数据可以看到,高MOI时敲减的效果更好。通过该部分试验,我们成功构建了三组特异性针对hMDR1的shRNA慢病毒载体,RNAi慢病毒的包装也同时完成,并在293T细胞中完成病毒包装后的滴度标定。我们又从三组重组载体中筛选出高效率的靶点,并明确不同MOI值的非特异的毒性差异,为下一步选用最高效率的重组载体对肾细胞癌ACHN细胞进行转染提供了可靠的依据。第二部分RNA干扰目的细胞效果评定及干扰后细胞生物学行为的改变前一部分试验我们构建出三组特异性针对hMDR1基因的vshRNA重组载体,并在目的细胞中对它们的转染效率和沉默效果进行了评价,从而成功地从中筛选出3#为最佳靶点,因此,在后续试验中,我们采用3#慢病毒重组载体,在生长状态良好的ACHN细胞中进行慢病毒转染,确定其对目的基因的干扰效果。简要介绍如下:培养生长状态良好的目的细胞（即ACHN细胞）,病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况,感染5天后收集细胞,采用Realtime PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,并提取蛋白,采用Western Blot的方法检测目的基因的蛋白表达情况,进而判断该靶点的干扰效果。试验结果显示,3# vshRNA能够成功的转染进入肾细胞癌ACHN细胞中。RealtimePCR结果显示该重组载体对ACHN细胞中MDR1基因的表达有显著敲减作用,在使用了polybrene试剂但未增加病毒液有效滴度的情况下,敲减效率提高到60%左右,而westernblot也证实了干扰后P-gp的表达明显减少,说明该靶点对目的基因有确定的沉默效果。在ACHN细胞中成功干扰MDR1基因后,其在RNA水平和蛋白水平上有了较大幅度的沉默。为进一步明确在MDR1基因被沉默后ACHN细胞的多药耐药行为是否出现变化,我们向细胞培养液中加入了临床常用的化疗药物长春新碱,采用CCK-8试剂盒法检测了ACHN细胞在MDR1基因沉默后的生长情况及对长春新碱敏感性的变化。由于意外观察到ACHN细胞在MDR1基因沉默后出现了生长抑制现象,我们用细胞计数法记录了细胞的生长情况,同时又应用流式细胞术检测了细胞凋亡水平以及基因p53、survivin等的变化情况,简要介绍如下:（1）CCK-8试剂盒方法检测RNA干扰MDR1基因并应用化学药物后细胞生长水平及耐药性变化:培养生长状态良好的目的细胞（即ACHN细胞及提前建立的耐VCR的ACHN/VCR细胞）,将已感染慢病毒重组载体的目的细胞分入96-well培养板培养,培养终止前4小时,每孔加入10ul CCK-8溶液,放入细胞培养箱中继续培养3—4小时,然后进行吸光度的测定,检测有效RNAi靶点干扰后的ACHN细胞生长水平及耐药性的变化。（2）PI染色流式细胞仪检测RNA干扰MDR1基因后细胞凋亡水平变化:培养生长状态良好的目的细胞（即ACHN细胞）,病毒感染前一天将细胞分入6-well培养板培养,感染当天按组加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染。5天后收集细胞进行PI染色流式细胞仪分析,检测有效RNAi靶点干扰MDR1基因后的ACHN细胞凋亡水平变化。（3）采用与筛靶部分方法类似的Real-time PCR检测干扰后的细胞中p53及survivin的基因表达情况。结果:干扰组的细胞应用药物后生长曲线较其它两组细胞（空白对照组以及无意义序列重组载体组）出现明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一结果提示在MDR1基因被干扰后,肾细胞癌细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力被抑制。耐药组细胞在干扰后应用VCR生长明显受抑制,反应性增强,说明细胞耐药性降低。通过PI染色流式细胞术检测转染沉默后细胞群体中各时期细胞的比例,我们发现,与其它两对照组比较,在MDR1基因被沉默后,ACHN细胞凋亡率大幅度增加,出现了特征性的凋亡峰。与之相符的是RT-PCR检测发现干扰后ACHN细胞p53、survivin表达亦明显减少。众多研究表明,多数疾病的发生发展与基因突变及修饰有关,如何特异性进行致病基因的修复或删除是目前基因治疗研究领域的热点。RNAi技术正由于其所具有的高特异性和高效性而日益成为基因治疗研究方向最常应用的工具。这些特性也正是以往的其它技术所无法达到的。但同时需要提到的是,与很多以往的基因治疗方式一样,如何使RNAi效果能够稳定长期的在细胞中实现是目前将RNAi技术运用于疾病基因治疗的一个难点。在本研究中,我们采用了慢病毒载体系统针对MDR1基因构建了shRNA重组载体,并成功在人肾细胞癌细胞株中实现了高效、特异、稳定的沉默效果。该基因被沉默后,我们看到肾细胞癌ACHN细胞对化学药物的反应显著增强,增殖周期延长,凋亡比例大幅增加等生物学行为的变化。基于以上实验结果,我们认为MDR1基因的确在肾细胞癌细胞的多要耐药过程中起到了关键的作用,可以成为未来逆转肾细胞癌化疗耐药的有效靶点,同时我们也发现,MDR1基因与mtp53及survivin基因的表达有关联,MDR1基因介导的多药耐药及其对肿瘤细胞凋亡的抑制作用至少部分是通过mtp53和survivin基因来实现的。而慢病毒载体系统作为基因治疗的载体构件,能够协助shRNA片段在细胞内实现RNAi效应高效稳定的表达,是进行基因治疗研究时非常理想的载体工具。