甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因及雄配子发育研究

论文摘要

油菜是食用植物油和植物蛋白的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白源，而且在现代工业上的用途也日益广泛。随着人们生活水平的不断提高，对油菜产量和品质的要求也相应提高，因此，开展油菜杂种优势利用研究，把品质育种与杂种优势利用结合起来，选育高产优质油菜品种已成为目前油菜育种的主攻方向。显性细胞核雄性不育（dominant genic male sterility）由于败育彻底、不育性稳定、无不良胞质效应等优势而受到重视，而且目前通过利用纯合两型系、临保系（temporary maintainer line）和恢复系，已经可以实现“三系化”繁殖、制种。但是，在实际应用中，选育纯合两型系和恢复系仍然是比较困难的工作，而且到目前为止，对这一材料的育性控制机制仍然了解的很少，因而为了更好的利用显性核不育的材料，很有必要对其进行深入的研究。本研究以甘蓝型油菜显性核不育纯合两型系Rs1046AB为研究对象，运用多种差异表达分析技术（DDRT-PCR，cDNA-AFLP，SSH and cDNA microarray）对姊妹系的正常植株和不育植株间差异表达的基因进行了研究。取得的实验结果和主要结论如下：1．DDRT-PCR，用3个锚定引物和26个随机引物，共78对引物组合对Rs1046AB的可育株和不育株进行了差异表达分析，最终得到可以重复出现的差异片段26个（20个在可育材料中增强或特异表达，6个在不育材料中增强表达），但随后的反向Northern杂交结果表明，获得的差异片段都为假阳性片段。2．cDNA-AFLP，共筛选了256对引物组合，每对引物组合能产生大约20个条带，其中23对引物组合（8.98％）具有多态性，可以重复扩增出的差异片段有32个（只占所有扩增片段的0.31％），经Blast分析，这些片段归属于28个unigene（其中在可育株中上调表达的有27个，不育株中只有1个），生物信息学分析表明28个unigene共参与了8个生物过程（不包括功能未知的），其中只有11个片段所参与的过程是已知的，包括代谢、转录、细胞周期、蛋白质命运、细胞间运输、信号转导和花发育等，这些过程与雄配子的发育都有关系，其余17个（约60.7％）片段没有同源性或功能未知，表明可能得到了与雄配子发育相关的新基因。Northern杂交的结果进一步验证了cDNA-AFLP数据的可靠性。3．利用SSH构建了正向（可育材料作为“Tester”，即富集了可育材料中上调表达的基因）和反向（不育材料作为“Tester”，即富集了不育材料中上调表达的基因）两个文库，每个文库中包含3072个克隆，经扩增，纯化后每个文库都得到了单带且条带较亮的克隆2000多个（正向文库2081，反向文库2293），片段大小平均在500 bp左右。4．将上述每个文库中经纯化后的2000多个克隆，外参（λDNA扩增片段），内参（actin，β-tubulin和BNACBP）以及阴性对照（人类TFR和pUC19）在大连Takara公司点制成cDNA microarray，其中纯化后的克隆在每张芯片上重复点两次，每个对照重复点48次，芯片的杂交和分析工作按照正常的操作流程进行，最终在正向文库中筛选得到1369个上调表达的克隆，而反向文库中仅有12个上调表达的克隆（比值≥12）。通过点杂交去除重复克隆后，最终对其中400个克隆进行了测序，Blast分析表明它们归属于216个unigenes（212个在可育材料中上调表达，4个在不育材料中上调表达），生物信息学分析发现可育材料中上调表达的212个基因中，178个可以在NCBI找到同源序列。根据其参与的生物学过程，它们可以划分为17个组（不包括未分类的蛋白），其中参与代谢，细胞防御，细胞组分的生物合成以和蛋白命运的占的比例最大，分别占11.11％，7.69％，6.55％和5.70％。在正向文库中，从所测序列中选取9个进行Northern杂交验证，结果有8个与芯片结果一致，这说明了芯片结果的可信性；反向文库的4个序列中有1个结果与芯片结果一致。5．细胞学观察发现，Rs1046AB的不育株在减数分裂过程的初期，所有细胞都呈细胞核浓缩状态，表明它们已经开始降解。虽然在相当于正常植株的四分体时期，有31％的细胞能够脱离浓缩状态而继续发育，但是在染色体状态为粗线期时，所有细胞又停止其发育，这一过程中，有部分细胞的染色体出现随机分裂，有些细胞则可以观察到核质桥和微核的出现。即使当“拟小孢子”（microspore’s analogue）出现时，这些细胞核浓缩的细胞和脱离浓缩状态的不正常细胞也能被观察到。而这些都表明不育材料中的染色体变得很不稳定。因此，结合差异表达的筛选结果，我们推测，造成这种现象的原因可能是由于DNA错误信息的存在导致减数分裂过程中的一些检测点（checkpoint）被激活，而不育植株中由于DNA损伤修复不能正常进行，因而不能完成减数分裂过程。本研究对通过cDNA芯片筛选到的参与DNA修复的3个ESTs进行了RT-PCR的研究，结果显示这3个ESTs在两材料间的表达存在明显差异：1个在不育材料中不表达，2个在不育材料中表达量剧减，而且这三个基因都只在花蕾中表达。6．利用KEGG Orthology（KO）-Based Annotation System（KOBAS）软件对正向文库中的差异表达序列进行了分析，结果212个序列中有41个（19.34％）被分配到47个KO本体中，通过分析，共得到9个可能与雄配子发育相关的途径，其中氮素代谢，硝基苯降解和淀粉、蔗糖代谢三条途径可能在雄配子发育过程中有着重要作用（P＜0.05），特别是氮素代谢和硝基苯降解（False Discovery Rate（FDR）＜0.05）这两个途径。7．对15个可能与雄配子发育相关的ESTs进行了时空表达模式研究。时间表达模式研究以不同发育时期（1-5 mm）的花蕾为材料，通过Northern杂交分析表明其中有9个ESTs的表达在不育材料中被完全抑制，而其余6个ESTs虽然在两个材料中都有所表达，但是它们的表达模式很不一致。Quantity One?软件的定量分析表明，在可育材料中大部分ESTs集中在1-3mm左右的花蕾中表达；而在不育材料中，各个时期除了能观察到部分基因的表达被完全抑制外，还有部分基因的表达时间出现了滞后现象，这说明不育材料中不仅基因的表达量有所改变，而且其表达时间也有所影响。空间表达的RT-PCR结果表明，有6个ESTs是花药特异表达的，有6个ESTs的表达具有组织偏向性，其中5个偏向于在花蕾中表达，还有3个ESTs在各个组织中表达量相似。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 油菜显性细胞核雄性不育的研究
• 1.1.1 油菜核不育材料的来源及分类
• 1.1.2 油菜显性核不育的分类、遗传特点及其应用
• 1.1.3 油菜显性细胞核雄性不育的形态特征
• 1.1.4 油菜显性细胞核雄性不育的细胞学研究
• 1.1.5 油菜显性细胞核雄性不育的分子生物学研究
• 1.1.5.1 不育基因的定位研究
• 1.1.5.2 恢复基因的定位研究
• 1.2 植物雄配子发育研究
• 1.2.1 雄配子发育过程
• 1.2.2 雄配子发育过程中的相关基因
• 1.2.2.1 与雄配子发育起始相关的基因
• 1.2.2.2 与减数分裂相关的基因
• 1.2.2.2.1 姐妹染色体粘合相关基因
• 1.2.2.2.2 染色体配对、联会及重组相关基因
• 1.2.2.2.3 同源染色体分离
• 1.2.2.2.4 胞质分裂过程
• 1.2.2.3 减数分裂后花粉发育相关基因
• 1.2.2.3.1 与花粉有丝分裂I相关的基因
• 1.2.2.3.2 生殖细胞有丝分裂中的相关基因
• 1.2.2.4 与绒毡层发育相关的基因
• 1.2.3 DNA修复与细胞周期检测点（cell cycle checkpoint）的相关性
• 1.3 差异表达研究中常用的实验技术
• 1.3.1 基于PCR技术的基因差异表达分析技术
• 1.3.2 基于消减杂交和PCR技术的基因差异表达分析技术
• 1.3.3 基于测序技术的基因差异表达分析技术
• 1.3.4 基于大规模杂交的基因差异表达分析技术
• 1.3.5 生物信息学
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 差异表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 总RNA抽提
• 2.1.2.2 DDRT-PCR
• 2.1.2.2.1 第一链cDNA的合成
• 2.1.2.2.2 PCR扩增
• 2.1.2.2.3 差异片段的回收
• 2.1.2.3 cDNA-AFLP
• 2.1.2.3.1 第一链cDNA的合成
• 2.1.2.3.2 第二链cDNA的合成（LD-PCR）
• 2.1.2.3.3 AFLP
• 2.1.2.4 SSH
• 2.1.2.4.1 第一链cDNA的合成
• 2.1.2.4.2 第二链cDNA的合成
• 2.1.2.4.3 Rsa I酶切
• 2.1.2.4.4 接头连接
• 2.1.2.4.5 第一轮杂交
• 2.1.2.4.6 第二轮杂交
• 2.1.2.4.7 两轮PCR扩增
• 2.1.2.4.8 差减效率检测
• 2.1.2.5 连接与转化
• 2.1.2.6 cDNA microarray筛选
• 2.1.2.6.1 文库的扩增与精制
• 2.1.2.6.2 点样及后处理
• 2.1.2.6.3 RNA抽提
• 2.1.2.6.4 荧光探针标记
• 2.1.2.6.5 芯片杂交、洗涤和扫描
• 2.1.2.6.6 数据分析
• 2.1.2.7 数据验证
• 2.1.2.7.1 RT-PCR
• 2.1.2.7.2 反向Northern杂交
• 2.1.2.7.2.1 点膜及后处理
• 2.1.2.7.2.2 预杂交
• 2.1.2.7.2.3 探针标记
• 2.1.2.7.2.4 杂交
• 2.1.2.7.2.5 洗膜
• 2.1.2.7.3 Northern杂交
• 2.1.2.7.3.1 转膜及其后处理
• 2.1.2.7.3.2 探针标记
• 2.1.2.8 EST测序、检索及功能分类
• 2.1.2.9 细胞学观察
• 3 结果与分析
• 3.1 DDRT-PCR
• 3.2 cDNA-AFLP
• 3.2.1 双链cDNA的合成
• 3.2.2 cDNA-AFLP
• 3.2.3 序列分析
• 3.2.4 Northern杂交
• 3.3 SSH
• 3.3.1 双链cDNA的合成及酶切
• 3.3.2 差减效率检测
• 3.3.3 差减文库的构建
• 3.4 cDNA microarray
• 3.4.1 cDNA microarray的构建
• 3.4.2 差异片段的筛选
• 3.4.3 序列分析
• 3.4.4 正向文库上调表达EST的功能归类
• 3.4.5 芯片数据验证
• 3.5 细胞学观察
• 3.6 DNA损伤修复相关基因的RT-PCR研究
• 3.7 利用KOBAS鉴定与雄配子发育相关的途径
• 3.8 与雄配子发育相关EST的表达模式研究
• 3.8.1 时间表达模式研究
• 3.8.2 空间表达模式研究
• 4 讨论
• 4.1 实验方法的比较
• 4.2 显性细胞核雄性不育机制探讨
• 4.2.1 纺锤体形成异常
• 4.2.2 细胞周期检测点（cell cycle checkpoints）
• 4.2.3 DNA修复功能缺陷
• 4.2.4 雄性不育的可能机制
• 4.3 雄配子发育研究
• 4.3.1 筛选到与雄配子发育相关的基因
• 4.3.2 正向文库中上调表达基因的功能分类
• 4.3.3 参与雄配子发育的重要途径
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢
• 附录