论文摘要
研究背景脑胶质瘤（Glioma）是最常见的颅内原发性肿瘤,约占颅内原发性肿瘤总数的70%,其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM, WHOⅣ级）是恶性程度最高的组织学类型,具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点。近年来,无论是显微手术、放化疗还是免疫治疗均取得了巨大进步,但胶质母细胞瘤患者的预后仍然很不理想,两年总体生存率仅有27%。肿瘤细胞沿脑白质束浸润性生长是脑胶质瘤易于复发、难以根治的根本原因,因此阐明胶质瘤侵袭性生长的内在调节机制,将有助于发现抗胶质瘤侵袭的治疗靶点,改善胶质瘤患者的预后。细胞侵袭迁移是一个复杂的过程,主要包括细胞外基质的降解、细胞与细胞外基质的粘附与脱离、细胞侵袭性结构的形成及细胞骨架变形等多个方面。其中细胞外基质的降解过程曾被认为是细胞侵袭的限速环节,该过程由各种蛋白水解酶类完成,其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）最受重视,被认为是细胞外基质降解过程中的主要蛋白水解酶。MMP2及MMP9是MMPs家族中两个最重要的成员,因为可以分解细胞外基质的主要成分—Ⅳ型胶原纤维而倍受瞩目。MMPs家族抑制剂（matrix metalloproteinases inhibitor, MMPI）可以显著抑制肿瘤细胞在体外三维基质培养体系中的侵袭,临床实验结果也表明MMPI的应用可以在一定程度上抑制肿瘤细胞的侵袭转移,但肿瘤患者的总体生存率却未见显著提高,这驱使人们重新思考肿瘤侵袭的机制及治疗策略。近年来细胞骨架重构在肿瘤细胞侵袭迁移过程中的作用日益受到重视并逐渐成为新的研究热点。细胞骨架由微丝、微管和中间纤维构成,目前与细胞迁移相关的研究主要集中于微丝。根据迁移策略、突破组织屏障的方式及与细胞外基质的相互作用等方面的不同可以将细胞的运动方式分为两种,即阿米巴样细胞运动（amoeboid movement）和间充质样细胞运动（mesenchymal movement）,人脑胶质母细胞瘤正是间充质样细胞运动的典型。在间充质样细胞运动中,微丝构成的与迁移有关的结构主要有丝状伪足（filopodia）、板状伪足（Lamellipodia）及张力纤维（stress fibers）。丝状伪足是由肌动蛋白纤维平行排列形成的细小（0.1-0.3μm）指样突起,可以探测细胞外信息；板状伪足是细胞前缘由肌动蛋白呈网状排列构成的薄片状（0.1-0.2μm）结构,能提供足够的支持力以使细胞膜表面形成突起；张力纤维是细胞内部由反向平行的肌动蛋白纤维及肌球蛋白Ⅱ（myosinⅡ）构成的一种可收缩性结构,在粘附结构的协同作用下为细胞收缩提供动力。在间充质样细胞运动过程中,首先由丝状伪足对细胞周围环境进行探测,接着肌动蛋白以板状伪足为支持物大量聚合将细胞膜向前顶起,形成细胞前端突起,随后细胞突起与底物之间发生粘附,进而张力纤维收缩拉动细胞核及细胞器向前端移动,最后细胞尾端与底物之间粘附作用解除,细胞膜也随之前移,细胞完成在平板培养体系中的“爬行”。任何影响细胞外基质降解及细胞变形能力的因素均可影响肿瘤细胞的侵袭行为。肿瘤微环境显著影响肿瘤细胞的生物学行为,导致肿瘤细胞对放、化疗敏感性的改变及增殖、凋亡及侵袭能力的变化。肿瘤微环境中大量存在的各种细胞因子及低氧分压是改变肿瘤细胞生物学行为的重要始动因素。白细胞介素6 （Interleukin-6, IL-6）是一种多功能细胞因子,参与机体造血、免疫及炎症反应。近年来研究发现,IL-6在多种肿瘤细胞如前列腺癌、乳腺癌、肺癌及胶质母细胞瘤中高表达,并参与肿瘤增殖、凋亡及迁移等生物学性状的调节。在胶质母细胞瘤患者,血清IL-6水平可在一定程度上可以预测患者的预后。此外,IL-6基因敲除后的小鼠自发性胶质瘤的发生率较母系鼠相比明显下降,以上均提示IL-6在胶质瘤的发生、发展中具有重要的调节作用。虽然IL-6在人脑胶质母细胞瘤增殖过程中的作用已经早有研究,但是否也影响人脑胶质母细胞瘤的迁移能力目前还不清楚。低氧（Hypoxia）是直径大于2mm的肿瘤组织的显著性特征。虽然胶质母细胞瘤是人体最富血管的肿瘤之一,但由于肿瘤细胞生长代谢旺盛及血管结构异常,肿瘤组织仍然高度缺氧并常在肿瘤中心形成坏死区。低氧可以显著上调包括胶质母细胞瘤在内的多种肿瘤细胞的侵袭迁移能力,但其具体机制目前仍存在争议。巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是一种受低氧调节的多功能细胞因子,参与机体免疫与炎症反应。近年来发现MIF可以增强多种肿瘤细胞的侵袭迁移能力。低氧下人脑胶质母细胞瘤迁移能力上调是否与MIF表达上调相关及MIF调节细胞侵袭迁移的具体机制目前尚不清楚。本课题包含部分,分别研究IL-6及低氧对人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移能力的影响,并探讨其机制,以期能为人脑胶质瘤的抗侵袭治疗提供一定的理论依据。一. IL-6对人脑胶质瘤母细胞瘤侵袭迁移能力的影响及机制研究目的1.检测人脑胶质瘤组织标本及细胞系中IL-6的表达情况2.研究IL-6对人脑胶质母细胞瘤侵袭及迁移的影响3.研究IL-6促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制4.研究介导IL-6促人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的细胞内信号传导通路5.研究IL-6对人脑胶质瘤血管生成的影响方法1.人脑胶质瘤组织标本及细胞系中IL-6的表达收集3例人脑胶质瘤、1例胶质瘤瘤旁组织、1例正常脑组织及1例高血压脑出血患者的组织标本。RT-PCR检测人脑胶质瘤组织标本及细胞系中IL-6基因表达情况。2.IL-6对人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251侵袭及迁移的影响①生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,收集细胞,无血清培养基调整细胞浓度为1x105/ml,分别加不同浓度IL-6刺激。200μl上述细胞悬液分别加入Transwell小室上室,下室加入含血清培养基诱导（T98G 20%,U251 10%）,培养12h后取出小室,经固定、染色后照相,随机选取5个视野计数穿过上室基底膜的细胞数并进行统计学分析。②生长良好的T98G及U251细胞2×105/孔接种6孔板,待细胞生长到70%融合时更换无血清培养基饥饿6h,使用10μl微量加样器枪头作3条平行划痕,分别于0、12、24h在相同部位拍照,测量划痕宽度,并进行统计学分析。③生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,3x103/孔接种96孔板,并用不同浓度IL-6进行处理,分别在不同时间点采用MTT法检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤增殖的影响。3.IL-6促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制①生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,采用含有不同浓度IL-6的完全培养基培养24h,RT-PCR检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤MMP2/9基因表达的影响。②生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,采用含有不同浓度IL-6的完全培养基培养24h, Western blot检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤MMP2/9蛋白表达的影响。③生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,采用含有不同浓度IL-6的无血清培养基培养24h,收集上清,明胶酶谱法检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤上清中MMP2/9活性的影响。④生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h后,采用含有不同浓度IL-6的完全培养基培养24h, Western blot检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤Fascin-1蛋白表达的影响。⑤24孔板内预先放置盖玻片,生长良好的T98G及U251细胞2×104/孔接种,培养过夜,制作细胞爬片。更换含有不同浓度IL-6的完全培养基培养24h,原位免疫荧光染色观察IL-6对Fascin-1在人脑胶质母细胞瘤细胞内分布的影响。⑥24孔板内预先放置盖玻片,生长良好的T98G及U251细胞2×104/孔接种,培养过夜,制作细胞爬片。经1%血清培养基培养18h,更换无血清培养基培养6h,不同浓度的IL-6处理10min,罗丹明标记的鬼笔环肽免疫荧光染色观察IL-6对人脑胶质母细胞瘤细胞骨架的影响。4.IL-6促人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的细胞内信号传导通路研究①生长良好的T98G及U251细胞无血清饥饿6h,采用含有不同浓度IL-6的无血清培养基培养20min, Western blot检测IL-6对人脑胶质母细胞瘤JAK/STAT3、MAPK/ERK及PI3K/AKT信号通路活化的影响。②生长良好的T98G及U251细胞,经1%血清培养基培养18h,后更换无血清培养基培养6h,不同浓度的IL-6处理10min,G-LISA检测RhoGTPases成员RhoA、Rac1及Cdc42活性的变化。5.IL-6对胶质瘤血管生成的影响①生长良好的人脑胶质母细胞瘤U251更换无血清RPMI 1640培养基,培养6小时后收集上清。②收集生长良好的血管内皮细胞ECV-304,分别使用RPMI 1640、胶质瘤上清RPMI 1640、RPMI 1640+IL-6及胶质瘤上清RPMI 1640+IL-6 Ab重悬,调整细胞浓度为1×105/ml。200μl上述细胞悬液分别加入Transwell小室上室,下室加入RPMI 1640完全培养基诱导,培养12h后取出小室,经固定染色后照相,并随机选取5个视野计数穿过上室基底膜的细胞数进行统计学分析。③收集生长良好的血管内皮细胞ECV-304, RT-PCR检测ECV-304中IL-6及IL-6受体亚基gp80和gp130的表达情况。结果1.人脑胶质瘤组织标本及细胞系中IL-6的表达在所检测的3例胶质瘤及1例胶质瘤瘤旁组织标本中,均存在IL-6基因表达,在正常脑组织中未检测到IL-6基因表达,在所检测的1例高血压脑出血患者减压组织中也存在IL-6基因表达。所有被检测的3种人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G、U87及U251均存在IL-6基因水平表达。2.IL-6对人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251侵袭及迁移的影响Transwell侵袭及迁移实验均表明IL-6可以剂量依赖性促进人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U251的侵袭及迁移,与空白组相比,高浓度IL-6作用下具有统计学意义（p<0.05）。损伤修复实验表明,IL-6可以剂量依赖性促进人脑胶质母细胞瘤U251的非趋化性迁移能力,却抑制T98G细胞的非趋化性迁移能力。MTT结果表明,在本研究中侵袭迁移实验所采用的实验条件下,T98G细胞的增殖能力轻度受抑制,而U251细胞的增殖能力轻度增强,但均无统计学意义。3.IL-6促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制RT-PCR、Western blot结果显示IL-6可上调人脑胶质母细胞瘤细胞T98G和U251 MMP9基因及蛋白的表达水平,而不影响MMP2的表达水平。明胶酶谱法显示人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G及U251上清中存在MMP2酶活性,但不受IL-6影响。在U251细胞系上清中检测到MMP9酶活性,且呈现IL-6剂量依赖性；在T98G细胞上清中,MMP9酶活性不明显。Western blot及免疫荧光染色结果显示IL-6可促进T98G及U251细胞Fascin-1的蛋白表达水平,并促进其向细胞边缘分布。细胞骨架免疫荧光染色结果显示IL-6可促进人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U251板状伪足的形成。4.IL-6促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的细胞内信号传导通路研究Western blot结果显示IL-6刺激后,T98G及U251细胞JAK/STAT3 Tyr705位磷酸化水平变化不明显,而Ser727位磷酸化水平升高,且呈现IL-6剂量依赖性。T98G及U251细胞中均存在高水平的p-AKT,但不受IL-6刺激的影响。IL-6可促进U251细胞p42/44 MAPK的磷酸化水平,而抑制T98G细胞p42/44 MAPK的磷酸化水平。G-LISA结果显示IL-6可明显促进Rac1-GTPase活性,而对RhoA、Cdc42活性影响不大。5.IL-6对胶质瘤血管生成的影响Transwell实验结果显示人脑胶质母细胞瘤培养上清可明显促进血管内皮细胞ECV-304的迁移能力,IL-6多克隆抗体可抑制胶质瘤上清对ECV-304迁移的促进作用。RT-PCR结果显示在血管内皮细胞ECV-304中存在IL-6及IL-6R的表达。结论1.胶质瘤组织标本及细胞系中存在IL-6表达2.IL-6可促进人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G及U251的侵袭及迁移3. IL-6促进人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G及U251 MMP9的表达4.IL-6促进人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G及U251 Fascin-1的表达并改变其分布5. IL-6促进人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G及U251板状伪足的形成6. JAK/STAT3及Rac1信号介导IL-6对人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U251迁移的促进作用7. IL-6可以以旁分泌方式促进胶质瘤血管生成二.低氧对人脑胶质瘤母细胞瘤侵袭迁移能力的影响及机制研究目的1.研究低氧对胶质母细胞瘤侵袭迁移的影响2.研究低氧促进胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制3. MIF与低氧诱导胶质母细胞瘤迁移能力增强的相关性研究4.研究胶质母细胞瘤中MIF信号各节点分子的表达情况方法1.低氧对胶质母细胞瘤侵袭迁移的影响收集生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87,重悬于无血清DMEM培养基中,调整细胞浓度为1×105/ml,200μl上述细胞悬液分别加入Transwell小室上室,下室加入含血清培养基诱导（T98G 20%,U87 10%）,分别在第4、8h将一处理组送入低氧培养箱（37℃,5% CO2、1% O2）,第12h终止实验,取出各小室,经固定染色后照相,随机选取5个视野计数穿过上室基底膜的细胞数并进行统计学分析。2.低氧促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制①生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87,更换无血清培养基,分别在0、4、8h将不同处理组送到低氧培养箱培养,12h结束实验,收集上清,明胶酶谱法检测不同处理组上清中MMP2/9的活性。②24孔板中预先放置盖玻片,2x104/孔接种生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87,过夜后,将低氧组置入低氧培养箱中培养24h,制作细胞爬片。首先光镜下观察低氧培养下人脑胶质母细胞瘤形态学的变化,然后再用罗丹明标记的鬼笔环肽行细胞骨架染色,观察低氧下人脑胶质母细胞瘤细胞骨架的变化。③生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U871x105/孔接种6孔板,过夜后分别在常氧及低氧培养箱中培养24h。G-LISA检测低氧培养下人脑胶质母细胞瘤RhoGTPases成员RhoA、Rac1及Cdc42活性的变化。3.MIF与低氧诱导人脑胶质母细胞瘤迁移能力增强的相关性研究①生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87 1x105／孔接种6孔板,过夜后分别在常氧及低氧培养箱中培养24h。收集细胞,RT-PCR及Western blot分别在基因及蛋白水平上检测低氧培养的人脑胶质母细胞瘤MIF表达水平的变化。②收集生长良好的T98G及U87细胞,无血清培养基调整细胞浓度为1x105/mI,分别加不同浓度的MIF刺激。200μl上述细胞悬液分别加入Transwell小室上室,下室加入含血清培养基诱导（T98G 20%, U251 10%）,常氧下培养12h后取出小室,经固定染色后照相,并随机选取5个视野计数穿过上室基底膜的细胞数进行统计学分析。③24孔板中预先放置盖玻片,2x104／孔接种生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87,制作细胞爬片。培养过夜后分别在含有不同浓度重组MIF的培养基中培养24h。首先光镜下观察MIF处理后人脑胶质母细胞瘤形态学的变化,然后再用罗丹明标记的鬼笔环肽行细胞骨架染色,观察MIF处理后人脑胶质母细胞瘤细胞骨架的变化。④合成针对MIF的siRNA序列,lipofectamineTM 2000转染T98G及U87细胞,RT-PCR及Western blot分别检测在基因和蛋白水平上的沉默效果,筛选干扰效果良好的序列。⑤MIF siRNA转染T98G及U87细胞,24h后收集细胞,分别在常氧及低氧培养条件下行Transwell实验,观察MIF siRNA对人脑胶质母细胞瘤迁移的影响。⑥MIF siRNA转染T98G及U87细胞,24h后收集细胞,分别设空白组、control siRNA组、siRNA组、siRNA+MIF组接种24孔板,制作细胞爬片。在低氧环境下培养24h,罗丹明标记的鬼笔环肽染色,观察MIF siRNA对细胞骨架的影响。4.人脑胶质母细胞瘤中MIF信号各节点分子的表达情况收集生长良好的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87,1x105/孔接种6孔板,过夜后分别在常氧及低氧培养箱中培养24h。RT-PCR检测MIF信号通路中各节点分子CD74、CD44、Tiam-1、Vav2、p115RhoGEF、RhoA、Rac1及Cdc42的表达情况。结果1.低氧对人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的影响与对照组相比,低氧培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87侵袭性增强,而且随低氧处理时间的延长穿过小室基底膜到达下表面的细胞也增多,差别具有统计学意义（p<0.05）。2.低氧促进人脑胶质母细胞瘤侵袭迁移的分子机制①低氧培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87上清中MMP2及MMP9活性未见明显变化。②光镜下见低氧环境下培养的人脑胶质母细胞瘤胞体更加细长,极性增强。细胞骨架免疫荧光染色见细胞内张力纤维形成明显增多。③G-LISA检测结果显示在低氧环境下培养的人脑胶质母细胞瘤Rac1活性增强,RhoA活性下降,Cdc42活性变化不明显。3.MIF与低氧诱导人脑胶质母细胞瘤迁移能力增强的相关性研究①RT-PCR及Western blot结果显示在低氧环境下培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87中MIF基因及蛋白表达水平均有明显升高。②Transwell结果显示外源性MIF可以明显增强人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87的迁移能力。③光镜下观察见外源性MIF刺激后T98G与U87细胞变得更加细长,细胞极性增强。细胞骨架免疫荧光染色结果显示外源性MIF可以促进人脑胶质母细胞瘤张力纤维的形成。④RT-PCR及Western blot结果显示MIF siRNA S2序列可显著抑制人脑胶质母细胞瘤中MIF基因及蛋白表达水平。⑤Transwell结果显示转染MIF siRNA后人脑胶质母细胞瘤细胞T98G和U87在常氧及低氧环境下迁移能力均明显下降。⑥细胞骨架免疫荧光染色结果显示MIF干扰后低氧诱导人脑胶质母细胞瘤张力纤维形成的作用消失。4.人脑胶质母细胞瘤细胞中MIF信号各节点分子的表达情况RT-PCR结果显示人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87均表达MIF信号通路中各节点分子,如CD74、CD44、Tiam-1、Vav2、p115RhoGEF、RhoA、Rac1及Cdc42。结论1.低氧培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87侵袭迁移能力明显增强2.低氧培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87上清中MMP2/9活性变化不明显3.低氧培养的人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87细胞骨架发生重排,细胞更加细长,富有极性,细胞内张力纤维形成增多4. MIF介导低氧对人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87迁移能力的促进作用5.人脑胶质母细胞瘤细胞T98G及U87表达MIF信号通路各节点分子
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