论文摘要
【研究背景】肺癌的发病率与死亡率居恶性肿瘤之首，严重威胁人类生命与健康。肺癌以NSCLC最为常见，化疗为主的综合治疗为其主要治疗手段。吉西他滨（Gemcitabine，Gem）是治疗NSCLC的一线化疗药物，然而其单药用于NSCLC的有效率仅20％～30％，与铂类等联合用药的有效率也不超过54％，肿瘤细胞对其原发与获得性耐药严重影响其临床治疗疗效，目前认为Gem耐药主要与其摄取转运过程障碍和胞浆内药物代谢酶异常有关。胞浆-5’-核苷酸酶-Ⅱ（Cytosolic 5’-nucleotidaseⅡ，CN-Ⅱ）是细胞内重要的核苷代谢调节酶，兼具水解酶及磷酸转移酶双重活性，在维持胞内核苷酸库的平衡中发挥重要作用。既往研究表明CN-Ⅱ可能通过水解Gem的一磷酸活化产物dFdCMP使其不能继续磷酸化活化，从而导致肿瘤细胞对药物敏感性下降；而且CN-Ⅱ可能通过其对核苷代谢的调节作用间接影响其它参与Gem代谢相关酶所催化的反应，进一步影响Gem在肿瘤细胞内的代谢过程。但CN-Ⅱ与Gem耐药的相关性至今尚无肯定结论，而且其在NSCLC中的表达情况及其与Gem疗效的关系研究较少。【研究目的】本研究检测NSCLC亲代细胞及其Gem耐药系与肿瘤组织中CN-Ⅱ的表达情况，旨在初步探讨CN-Ⅱ与NSCLC及Gem耐药的相关性、分析CN-Ⅱ表达水平与Gem治疗疗效之间的关系，以期为Gem治疗NSCLC提供潜在的疗效预测分子指标。【研究内容】本研究主要分为以下四个部分：①人NSCLC亲代及其Gem耐药细胞系细胞特性研究：人肺腺癌Gem耐药细胞系A549／Gem及人大细胞癌Gem耐药细胞系H460／Gem为本室既往建立，本部分研究主要通过MTT法检测两耐药细胞的耐药指数，验证其耐药程度及稳定性，同时采用计数法绘制亲代A549、NCI-H460细胞及耐药细胞生长曲线并计算其倍增时间，以期对各细胞特性有所认识，亦为后续研究奠定基础；②采用RT-PCR方法检测各细胞中CN-ⅡmRNA的表达水平，以β-actin为内参计算各细胞CN-Ⅱ表达相对量，并比较亲代细胞与其对应Gem耐药细胞中CN-Ⅱ表达水平是否差异；③采用Westernblot及细胞免疫化学染色方法检测各细胞内CN-Ⅱ蛋白的表达情况，并比较亲代细胞与其对应Gem耐药细胞中CN-Ⅱ表达水平是否存在差异；将细胞内CN-Ⅱ在mRNA及蛋白水平的表达结果进行对比，分析二者是否一致；④采用EnVision免疫组织化学方法检测70例NSCLC患者其肿瘤组织中CN-Ⅱ表达情况，分析CN-Ⅱ表达与患者一般情况及临床病理特征之间的关系；并从中选出21例曾接受含Gem方案化疗的患者，分析其肿瘤组织中CN-Ⅱ表达水平与Gem疗效的关系，初步探讨CN-Ⅱ潜在的临床应用价值。【研究结果】可分为以下四部分：①人NSCLC亲代及其Gem耐药细胞系细胞特性研究：A、Gem对各细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为：A549细胞7.58+1.29μmol／L、A549／Gem细胞852.96+151.52μmol／L、NCI-H460细胞5.81±1.89μmol／L、H460／Gem细胞457.53+53.32μmol／L；Gem耐药细胞的耐药指数分别为A549／Gem细胞112.52、H460／Gem细胞78.75；两耐药细胞均高度耐药，且其耐药指数经重复测定数值相近，提示细胞耐药性稳定；B、分别绘制了亲代及耐药细胞的生长曲线，其倍增时间分别为：A549细胞30.429小时、A549／Gem细胞39.941小时、NCI-H460细胞39.539小时、H460／Gem细胞47.783小时；耐药细胞的倍增时间各自较其亲代细胞有所延长；②RT-PCR方法检测NSCLC亲代及其Gem耐药细胞中CN-ⅡmRNA表达：RT-PCR实验结果显示亲代及耐药细胞中均可检测到CN-ⅡmRNA表达，但其表达水平不尽相同。A、CN-ⅡmRNA在A549细胞中表达的相对含量为0.433±0.128，在A549／Gem细胞中表达的相对含量为0.832±0.139，二者相比有显著性差异（t=3.655，P＜0.05）；B、CN-ⅡmRNA在NCI-H460细胞中表达的相对含量为0.346±0.127，在H460／Gem细胞中表达的相对含量为0.587±0.101，H460／Gem细胞中CN-ⅡmRNA表达水平稍高于其亲代细胞，但二者相比未有显著性差异（t=2.583，P＞0.05）；C、同时亦比较了两亲代细胞A549与NCI-H460中CN-Ⅱ基因的表达相对量，结果提示二者之间无明显差异性（t=0.836，P＞0.05）由此可知，腺癌Gem耐药细胞CN-ⅡmRNA较其亲代细胞表达明显增高；大细胞癌耐药细胞CN-ⅡmRNA较其亲代细胞亦有所升高，但二者差别不明显。腺癌与大细胞癌的亲代细胞之间CN-Ⅱ表达无显著性差异。③Westernblot及细胞免疫化学染色方法检测细胞中CN-Ⅱ蛋白表达情况：结果显示亲代及耐药细胞中均可检测到CN-Ⅱ蛋白表达，但不同细胞其蛋白表达水平有所差别。A、免疫化学染色结果发现CN-Ⅱ阳性表达主要定位于胞浆，A549／Gem及H460／Gem细胞CN-Ⅱ表达水平较其亲代细胞为高；B、Westernblot实验结果显示，亲代及耐药细胞均有阳性的CN-Ⅱ蛋白条带检出，CN-Ⅱ蛋白条代位于56kDa处，不同细胞其蛋白表达量差别较大：两耐药细胞CN-Ⅱ蛋白表达各自较其亲代细胞为强；C、将蛋白表达结果与RT-PCR实验所检测的各细胞中CN-ⅡmRNA表达情况相比较可知，CN-Ⅱ转录水平与其蛋白表达水平基本一致。由此可知，NSCLC的Gem耐药细胞中CN-ⅡmRNA及蛋白的表达水平要高于其对应的亲代细胞，其中腺癌耐药细胞较其亲代细胞CN-Ⅱ表达增加的程度显著高于大细胞癌细胞。④EnVision免疫组化方法检测70例NSCLC患者肿瘤组织中CN-Ⅱ蛋白的表达，结果显示：A、70例NSCLC组织的CN-Ⅱ阳性表达率为52.9％，其阳性表达以胞浆阳性为主，部分细胞可有胞浆与胞核同时阳性表达；B、CN-Ⅱ表达水平与NSCLC患者的一般情况如年龄、性别、肿瘤分期及其分化程度均无显著相关性，腺癌与鳞癌之间及肿瘤原发灶与转移灶之间其CN-Ⅱ表达亦无显著性差异；C、分析其中21例曾接受含Gem方案化疗的NSCLC患者其CN-Ⅱ表达与Gem疗效之间的相关性，结果发现6例肿瘤进展（PD）的患者其CN-Ⅱ阳性表达比率为83.3％（5／6），其表达水平要较治疗有效（CR+PR，CN-Ⅱ阳性率16.7％）及疾病控制（CR+PR+SD，CN-Ⅱ阳性率33.3％）的患者为高（83-3％VS 16.7％，83.3％VS 33.3％，P＜0.05）。CN-Ⅱ在NSCLC肿瘤组织中表达的检测结果与细胞实验结果基本一致，CN-Ⅱ高表达可能提示肿瘤细胞对Gem耐药或敏感性降低，CN-Ⅱ蛋白有望作为一个具有潜在价值的分子指标来预测接受含吉西他滨方案化疗患者的治疗效果。【研究结论】通过以上研究可有如下结论：通过检测NSCLC细胞系及其肿瘤组织中CN-ⅡmRNA与蛋白水平的表达及分析其与Gem耐药的相关性研究中发现：CN-Ⅱ可能在NSCLC的Gem获得性耐药过程中发挥一定作用，Gem耐药细胞中的CN-Ⅱ表达水平要高于其亲代细胞，其中腺癌耐药细胞较其亲代细胞CN-Ⅱ表达增加程度较大细胞癌显著。CN-Ⅱ有望作为一个具有潜在价值的分子指标来预测Gem的疗效，CN-Ⅱ表达水平高的患者其肿瘤细胞可能对Gem耐药或敏感性降低。
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标签：肺肿瘤论文; 非小细胞论文; 胞浆核苷酸酶论文; 吉西他滨论文; 耐药论文; 免疫细胞化学染色论文; 免疫组织化学论文;