灿烂弧菌拮抗菌筛选及拮抗菌抑菌物质的研究

论文摘要

据统计,辽宁省海参养殖业已成为辽宁省的经济支柱产业,目前,海参养殖主要使用抗生素来预防治疗海参疾病,抗生素的添加不当和残留会危害到人类健康和环境的安全。海参体表菌群之间的拮抗作用对其自身的一些疾病的预防具有重要作用,保持体表菌群的稳定对于抑制病原菌的侵染和病害有着重要作用,使用生物防治方法不仅能降低养殖成本,也提高了海参产品的安全和健康性。本文选用实验室保存的海参体表和肠道相关微生物,采用交叉划线法和纸片法进行体外拮抗实验,筛选出致病性灿烂弧菌（Vibrio splendidus）的拮抗菌株,其中,用纸片法筛选出7株,交叉划线法筛选出6株。选择其中拮抗作用最强的1株菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CG,研究其培养条件的改变对拮抗活性的影响,对致病性灿烂弧菌（Vibrio splendidus）的拮抗机理以及其胞外分泌的拮抗物质。通过实验得知,待测菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CG产生拮抗活性的最适生长温度为25℃,它的最适生长pH值为6.0-7.5,在22h时拮抗活性最高,可以利用多种碳源,其中最适碳源为葡萄糖,可以利用有机氮源,而不能利用无机氮源,最适氮源为蛋白胨。通过对其拮抗机理的研究,得知,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CG主要通过营养物质与生存空间竞争以及胞外分泌拮抗物质这两种方式协同作用来抑制致病性灿烂弧菌（Vibrio splendidus）的生长。通过机理研究得知,该拮抗物质可以用有机试剂正丁醇萃取,中等极性,为进一步研究其拮抗物质,再经硅胶G薄层层析（展开剂体积比为氯仿：甲醇：甲酸=6：4：0.1）初步分离,用显色剂进行官能团显色反应,并辅以红外光谱分析测定拮抗物质的官能团,最终推断此拮抗物质为氨基糖苷类化合物。以氨基糖苷类化合物庆大霉素为标准品,纸片法快速测定拮抗物质的抑菌效价,得知该拮抗物质抑菌效价为2855u/mL。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 海参养殖
• 1.1.1 海参概况
• 1.1.2. 国内外海参养殖现状
• 1.1.3 养殖海参病害
• 1.1.3.1 海参致病菌种类
• 1.1.3.2 致病性灿烂弧菌
• 1.1.4 生物防治在海参养殖方面的发展前景
• 1.2 拮抗菌作用机理
• 1.2.1 菌株间拮抗机理
• 1.2.1.1 分泌抑菌物质
• 1.2.1.2 营养竞争
• 1.2.1.3 附着位点竞争
• 1.2.1.4 溶菌作用
• 1.2.1.5 降解或转化水体中的有害物质
• 1.2.2 枯草芽孢杆菌拮抗作用机理
• 1.2.2.1 拮抗作用的物质基础
• 1.2.2.2 影响枯草芽孢杆菌产生拮抗物质的因素
• 1.2.2.3 枯草芽孢杆菌抗菌物质的作用机制
• 1.2.2.3.1 作用于病原菌的细胞壁、细胞膜
• 1.2.2.3.2 作用于蛋白质合成系统
• 1.2.2.3.3 作用与能量代谢系统
• 1.2.2.3.4 与膜相关的受体蛋白相互作用,再与膜作用
• 1.3 拮抗菌筛选方法
• 1.3.1 交叉划线法
• 1.3.2 纸片扩散法
• 1.3.3 双层平板法
• 1.3.4 点种法
• 1.4 拮抗物质的提取
• 1.4.1 蛋白质类拮抗物质
• 1.4.2 其他类拮抗物质
• 1.5 本论文的研究内容与意义
• 第二章 拮抗菌株的筛选及机理研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验样品
• 2.2.2 主要培养基
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 拮抗菌筛选
• 2.3.1.1 交叉划线法
• 2.3.1.2 纸片法
• 2.3.2 培养条件对枯草芽孢杆菌CG拮抗活性的影响
• 2.3.2.1 遗传代数
• 2.3.2.2 培养温度
• 2.3.2.3 pH值
• 2.3.2.4 最适碳源
• 2.3.2.5 最适氮源
• 2.3.2.6 培养时间
• 2.3.3 拮抗机理研究
• 2.3.3.1 营养物质与生存空间的竞争
• 3.3.3.2 有机试剂萃取法分析拮抗物质
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 拮抗菌株的筛选
• 2.4.1.1 纸片法筛选结果
• 2.4.1.2 交叉划线法筛选结果
• 2.4.2 枯草芽孢杆菌CG培养条件对拮抗活性的影响
• 2.4.2.1 遗传代数
• 2.4.2.2 培养温度
• 2.4.2.3 pH值
• 2.4.2.4 最适碳源
• 2.4.2.5 最适氮源
• 2.4.2.6 培养时间
• 2.4.3 拮抗机理研究
• 2.4.3.1 营养物质和生存空间的竞争
• 2.4.3.2 有机试剂萃取法分析拮抗物质
• 2.4.3.2.1 有机试剂萃取液体法培养的胞外产物
• 2.4.3.2.2 有机试剂萃取固体法培养的胞外产物
• 第三章 枯草芽孢杆菌CG拮抗物质的提取和纯化
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验样品
• 3.2.2 主要培养基
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 拮抗物质的提取
• 3.3.2 拮抗物质的初步纯化
• 3.3.3 拮抗活性成分组分分析
• 3.3.3.1 官能团显色
• 3.3.3.2 红外光谱分析
• 3.3.3.3 抑菌物质效价的测定
• 3.3.3.4 抑菌谱的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 拮抗物质的提取纯化
• 3.4.2 拮抗物质化学成分分析
• 3.4.3 抑菌物质效价的测定
• 3.4.4 抑菌谱的测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢