论文摘要
目的:微小RNA（microRNA,miRNA）是一类非编码调控性单链小分子RNA,能够与特异性的靶mRNA通过碱基配对结合,对靶基因进行转录后水平调控。近年来的研究表明miRNA不仅参与正常细胞功能的调控,也在病毒与宿主之间的作用以及病毒复制等方面发挥着重要的作用。单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simpleX virus type 1,HSV-1）是一种DNA病毒,它可以引起口唇疱疹等疾病,并可以潜伏在三叉神经节形成潜伏感染。目前已经发现疱疹病毒本身可以编码病毒的miRNA,而且其表达的改变对病毒自身的复制有一定的作用,但宿主miRNA与病毒复制的关系并不是很明确,此研究的目的即探寻是否有宿主的miRNA参与了病毒复制的调控过程,这一调控过程是通过哪些基因实现的。方法:首先在HeLa细胞中,过表达和封闭miR-101后,利用病毒滴定空斑形成实验和real-time PCR分别检测病毒复制能力的变化。而后利用生物信息学方法筛选出miR-101的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-101对靶基因的直接调控作用。利用real-time PCR和western blot实验技术检测miR-101对靶基因mRNA和蛋白水平的表达变化。然后过表达靶基因的全长,进行挽救实验,进一步验证miR-101对靶基因的调控作用。利用RNA干扰技术敲除该靶基因后,通过病毒滴定空斑形成实验和real-time PCR实验检测靶基因对病毒复制的影响,进一步研究了该靶基因的功能。最后用real-time PCR检测HSV-1感染HeLa细胞后内源的miR-101和ATP5B的表达水平。结果:在HeLa细胞中,过表达miR-101后,病毒的复制明显受到抑制,病毒空斑的形成明显降低,病毒的DNA聚合酶基因的水平也明显降低。封闭miR-101后,病毒的复制增强,病毒的DNA聚合酶基因的水平也增加。靶基因筛选结果表明,ATP5B是miR-101的候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-101的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实,miR-101能够通过作用于ATP5B基因的3’非翻译区对其表达进行负性调节。在HeLa细胞中过表达miR-101,ATP5B的mRNA和蛋白水平都有明显降低;封闭miR-101后,ATP5B的mRNA和蛋白水平升高。此外,过表达不含3’UTR的ATP5B基因可以减弱miR-101对病毒增殖的抑制作用,病毒复制能力得到恢复。同时,在HeLa细胞中,敲降ATP5B后,病毒空斑的形成和病毒的DNA含量明显降低,与过表达miR-101相一致。在HSV-1感染HeLa细胞后,随着感染时间延长,miR-101的水平逐渐增加,其靶基因ATP5B的水平逐渐降低,二者呈现负相关性。结论:miRNA作为细胞基因转录后水平调节的内源性分子,参与调控病毒与宿主细胞的相互作用。本研究首次发现宿主细胞编码的miR-101具有抗病毒作用。miR-101通过降低靶基因ATP5B的表达而抑制HSV-1在HeLa细胞中增殖。在HSV-1感染HeLa细胞后,miR-101的水平逐渐增加,其靶基因ATP5B的水平逐渐降低,说明HSV-1可以通过抑制宿主的miRNA抗病毒作用来维持自身的增殖。首次确定miR-101及其靶基因对HSV-1复制的调控作用,有利于我们对病毒感染的发生和发展进行深入的了解,同时也为病毒感染的诊断和治疗提供新依据。
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