拟南芥抗草酸突变体的筛选和分析

论文摘要

拟南芥具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉等优点，且其基因组全序列测定工作已于2000年12月完成。为此，我们以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料，建立并优化拟南芥草酸突变体筛选体系，取得了如下主要结果：1、用草酸平板筛选法筛选拟南芥草酸抗性增强突变体，并确定了筛选压为1.2mmol／L。2、经过两轮在含有1.2mmol／L草酸的培养基上筛选得到草酸抗性增强突变体5株，通过TAIL-PCR扩增得到T-DNA插入侧翼序列，其中4株突变体D630、D282、D154、D74的T-DNA为同一插入位点，均插在At5g10450基因内部。另外1株突变体D33插在At2g39720、At2g39730两个基因的间区。3、我们从拟南芥种质资源库（ARBC）鉴定了At5g10450基因的SALK T-DNA插入缺失突变体，salk068774。发现该基因的缺失突变体并没有草酸抗性。4、构建了At5g10440、At5g10460基因的过表达载体，进行了拟南芥浸花转化并在含有basta的土壤中筛选得到一批转化苗。5、构建了草酸氧化酶的表达载体，用农杆菌介导转入拟南芥野生植株中并在含有basra的土壤中筛选得到一批转化苗。6、用菌核病菌接种突变体和野生型植株，发现突变体在一定程度上对菌核病菌的抗性有所增强。研究结果表明，植物对草酸的抗性与菌核病等病原菌的抗性具有较好的相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 草酸产生菌的研究进展
• 1.1.1 草酸是草酸产生菌的普遍且关键的致病因子
• 1.1.2 植物对草酸的响应可能部分地反映了植物对草酸产生菌的防御机制
• 1.2 菌核病的致病机制
• 1.2.1 菌核病菌的侵染
• 1.2.2 菌核病菌的致病机制
• 1.3 拟南芥相关研究进展
• 1.3.1 拟南芥的一般生物学特性
• 1.3.2 拟南芥的遗传学特性
• 1.3.3 拟南芥的分子遗传学特性
• 1.3.4 拟南芥的分子生物学研究策略
• 1.3.5 拟南芥突变体的获得
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 拟南芥突变体库及病原菌菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 克隆载体和转化菌株
• 2.1.4 生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥的种植
• 2.2.2 突变体的筛选方法
• 2.2.3 草酸抗性增强突变体的分析
• 2.2.4 草酸抗性增强突变体的分析
• 2.2.5 菌核病菌的接种方法
• 2.2.6 草酸氧化酶表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 突变体筛选浓度的确定
• 3.2 拟南芥抗草酸突变体的获得
• 3.3 T-DNA侧翼序列获得
• 3.4 At5g10450基因的功能缺失突变体的草酸抗性分析
• 3.5 At5g10440和At5g10460基因过表达载体的构建
• 3.5.1 重组质粒的酶切验证
• 3.5.2 重组质粒转化农杆菌感受态细胞
• 3.5.3 重组质粒的PCR验证
• 3.5.4 农杆菌浸花转化
• 3.5.5 转化苗的初步筛选
• 3.6 草酸氧化酶表达载体的构建
• 3.7 草酸抗性突变体的接种实验
• 4 讨论
• 4.1 草酸作为选择压力用于筛选抗性增强突变体是切实可行的
• 4.2 植物对草酸的抗性与对草酸产生菌的抗性相关
• 4.3 激活标签与TAIL-PCR方法相结合是进行功能基因组学研究的一种方法
• 4.4 转草酸氧化酶突变体有可能抗草酸和菌核病
• 5 小结
• 参考文献
• 附录一 测序序列
• 致谢