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小鼠胰岛细胞中烟酸受体检测及其功能研究

2020-12-06阅读(113)

小鼠胰岛细胞中烟酸受体检测及其功能研究

论文摘要

本文围绕小鼠胰岛细胞上发现的烟酸受体,并研究烟酸通过其受体传导的信号对胰岛素分泌的影响来解释烟酸与糖尿病病人血糖控制的关系。论文的主要工作概括如下:首先进行定量PCR检测烟酸受体PUMA-G在小鼠胰岛细胞上的转录水平。由于PUMA-G基因只有一个外显子,因此以没有经过反转录的RNA被用作阴性对照。结果显示PUMA-G基因在小鼠胰岛上有较高的转录水平。分别取小鼠腹下脂肪和脾脏组织作为阳性对照,发现PUMA-G在小鼠胰岛细胞上的转录水平和脂肪组织相当,略高于其在脾脏组织的转录水平。同时,发现了PUMA-G在小鼠胰腺组织的腺泡细胞中转录水平非常低,而小鼠胰岛细胞系（NIT-1,Min-6）中PUMA-G基因的转录,依然只有比较低的转录水平。由于PUMA-G基因在小鼠胰岛细胞上有较高水平的转录,我们进一步研究了通过PUMA-G介导的信号通路与小鼠胰岛素分泌的关系。其中包括两种重要的信号分子:Ca2+和cAMP。我们发现用烟酸作为配体激活PUMA-G蛋白受体介导的信号通路,对胰岛细胞胞内Ca2+的浓度不起作用。但存在IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）或Forskolin的情况下,胰岛细胞内cAMP的生成受到抑制,从而减少胰岛素的分泌。用PTX（百日咳毒素）处理胰岛细胞24h后,PUMA-G受体失活,烟酸对cAMP抑制作用明显降低,对胰岛素分泌水平的抑制也随之减弱。而且烟酸对cAMP的抑制作用随着烟酸浓度的增加而越来越明显。因此,可以认为烟酸通过刺激PUMA-G受体抑制小鼠胰岛细胞内cAMP的生成,从而降低了胰岛素的分泌。为了更直接地研究PUMA-G基因在小鼠胰岛细胞上的功能,用分子克隆的方法将PUMA-G基因连接在pEGFP-N1（绿色荧光蛋白）载体上。将带有PUMA-G基因的质粒通过电穿孔或脂质体转染的办法导入小鼠胰岛细胞系NIT-1,PUMA-G蛋白和EGFP蛋白共同表达形成融合蛋白。发现导入PUMA-G质粒使NIT-1细胞膜表面呈绿色,而对照组导入空载体的NIT-1细胞胞浆为绿色。表明PUMA-G蛋白成功地在NIT-1细胞内被高水平地表达,并定位在细胞膜上,为进一步研究PUMA-G基因在小鼠胰岛细胞中的功能打下了基础。有研究表明在胰腺切除及再生的过程中,伴随着一些基因转录水平的变化,其中不乏影响胰腺再生的功能基因。由于胰腺切除后小鼠体内的酮体（主要成分为3-羟基丁酸）浓度升高,而3-羟基丁酸为PUMA-G受体在小鼠体内天然存在的配体,因此,通过研究PUMA-G受体在小鼠胰腺切除及再生的过程中转录水平的变化。我们发现PUMA-G基因在小鼠胰腺切除后的1～4天内有升高的转录水平,提示PUMA-G可能与胰腺再生有一定的关系。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1. 概况
  • 2. 烟酸的性质及其临床用途
  • 2.1 烟酸的理化性质
  • 2.2 烟酸的药理学基础
  • 2.3 烟酸的调脂及抗动脉粥样硬化机制
  • 3 烟酸对糖尿病血脂紊乱的疗效
  • 4. 本论文研究工作的主要内容、意义
  • 第二章 胰岛细胞上烟酸受体的定量PCR检测
  • 1 PUMA-G基因
  • 2 PUMA-G基因在小鼠各种组织中的表达
  • 3 PUMA-G在小鼠胰岛中的表达
  • 3.1 实验方法：Real-time Q-PCR技术介绍
  • 3.2 实验材料
  • 3.3 胰岛的分离纯化
  • 3.4 小鼠脾脏及脂肪组织的获取
  • 3.5 总RNA提取
  • 3.6 反转录
  • 3.7 Real time PCR扩增（Taqman探针法）
  • 3.8 结果与讨论
  • 3.8.1 PUMA-G的定量PCR检测结果
  • 3.8.2 PUMA-G的转录水平与胰岛细胞上另一种G蛋白GLP-1R的比较
  • 3.8.3 定量PCR产物的鉴定
  • 4 小结
  • 第三章 PUMA-G基因的信号通路与胰岛素的分泌
  • 1 Gi蛋白偶联的受体介绍
  • 2 烟酸抑制胰岛细胞cAMP的生成
  • 2.1 实验方法和步骤
  • 2.2 实验结果和讨论
  • 2+的影响'>3 烟酸对胰岛细胞Ca2+的影响
  • 3.1 材料和仪器
  • 3.2 胰岛细胞钙离子检测方法和步骤
  • 3.3 结果与讨论
  • 4 烟酸对胰岛素分泌的影响
  • 4.1 实验材料
  • 4.2 实验方法及步骤
  • 4.3 结果与讨论
  • 5 小结
  • 第四章 PUMA-G高表达的胰腺细胞系的建立
  • 1 构建质粒载体pPUMAG-EGFP
  • 2 PCR克隆目的基因并连接入载体
  • 3 pPUMAG-EGFP载体瞬时转染入NIT-1 细胞
  • 4 讨论
  • 第五章 胰腺部分切除模型中PUMA-G基因转录的变化
  • 1 实验方法和步骤
  • 2 结果与讨论
  • 第六章 总结
  • 附录一 已提交文章I
  • 附录二 已提交文章II
  • 参考文献
  • 在校期间科研情况
  • 在校期间发表学术论文情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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