富氢溶液对雄性小鼠生精细胞的辐射防护效应与机制

论文摘要

背景：以往的研究已经表明，雄性生殖系统由干细胞增殖分化为精子的过程对电离辐射极为敏感，0.1Gy即可造成精原细胞的损伤。随着核技术广泛应用于能源领域、医学领域和工业领域，职业性工人、病人和公众暴露于电离辐射的危险性倍受关注。雄性生殖系统常因盆腔或下腹部放射治疗，或发生意外事故而受到电离辐射的影响，受照剂量较小时可出现暂时性生育能力下降，受照剂量较大时可导致永久性不育。因此，对雄性生殖系统的辐射损伤防护研究具有十分重要的社会需求。在辐射损伤医学防护研究领域，大部分防治措施主要针对的是电离辐射的间接作用。电离辐射对机体的危害方式可分为直接作用和间接作用。直接作用是电离辐射将其能量直接传递给生物大分子，使其发生电离而破坏，电离过程只需10–14秒就可完成，只能用物理屏蔽的方法来减轻电离辐射的直接作用。间接作用是电离辐射将其能量首先传递给生物大分子周围的水分子等介质，产生多种对机体有害的自由基，例如，羟自由基、水合电子和氢自由基等，这些自由基再作用于生物大分子使后者破坏，导致机体辐射损伤。虽然以往对雄性生殖系统辐射损伤医学防护开展过不少研究，至今除了物理屏蔽外，未找到一种较理想的防护手段。本教研室近年来发现氢气具有良好的辐射防护作用，可以保护培养的细胞、小鼠造血系统、小肠和心脏，降低死亡率。Terasaki等证明氢气可以防治小鼠的放射性肺炎。但是，关于氢气对雄性生殖系统是否同样具有辐射保护作用，未见研究报道。正是由于睾丸对电离辐射敏感以及对男性生育的重要性，本课题选择雄性小鼠为实验对象，研究氢气对雄性生精细胞的辐射防护效应及其作用机制。研究内容：1.富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐射损伤的防护效应1.1富氢溶液对受照小鼠精原细胞早期凋亡的防护作用1.1.1富氢溶液对受照小鼠生精细胞形态学的影响1.1.2富氢溶液对受照小鼠生精细胞DNA的影响1.2富氢溶液对受照小鼠精子发生的防护作用1.2.1富氢溶液对受照小鼠每日精子生成量的影响1.2.2富氢溶液对受照小鼠精子质量的影响1.3富氢溶液对辐照后小鼠睾丸组织的防护作用1.3.1富氢溶液对受照小鼠睾丸脏器指数的影响1.3.2富氢溶液对受照小鼠睾丸组织病理改变的影响1.3.3富氢溶液对受照小鼠睾丸小管分化指数的影响2.富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐射防护效应的作用机制2.1富氢溶液对羟自由基的清除作用2.1.1富氢溶液对芬顿反应产生的羟自由基的清除作用2.1.2富氢溶液对辐射分解水产生的羟自由基的清除作用2.1.3富氢溶液对受照小鼠睾丸内羟自由基的清除作用2.2富氢溶液对受照小鼠睾丸内氧化损伤的影响2.2.1富氢溶液对受照小鼠睾丸内内源性抗氧剂的影响2.2.2富氢溶液对受照小鼠睾丸内氧化损伤产物的影响2.2.3腹腔注射富氢溶液后睾丸内氢气浓度的变化实验方法：1.将高纯的氢气缓缓灌入生理盐水/磷酸盐缓冲液中，气体与液体的体积比为0.5:1，在0.4个大气压下2小时过饱和于生理盐水中。缓缓减压，再经过半小时，加压舱的气压降至常压时，将生理盐水袋取出，存放至4°C冰箱中。2.动物实验按照第二军医大学的有关规定进行。小鼠被随机分为正常组、给氢组、照射组和照射给氢组，在塑料模具中腹部向源，接受全身照射。照射剂量5Gy，剂量率2Gy/分钟。3.照射后12小时，使用HE染色法和TUNEL法评价生精细胞的凋亡情况。HE染色中，光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。TUNEL染色中，光学显微镜下细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。4.照射后29天，检测睾丸的重量、精子头计数和睾丸的组织学变化。29天时间刚好是精原细胞分化发育为精子的时间。照后29天检测，反应了29天前照射时精原细胞受损的情况。5.照射后35天，检测睾丸生精小管分化指数，反应了35天前照射时生精干细胞受损的情况。照射后56天，检测每日精子生成量和精子质量，反应了56天前照射时生精干细胞受损的情况。6.使用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物做为自旋捕获剂来捕获由芬顿反应产生的羟自由基。使用0.1mM的过氧化氢和0.03mM的亚铁离子在35mM的DMPO体系中发生羟自由基，迅速将该体系置于ESR中检测，ESR扫描30秒，叠加6次。7.使用羟自由基荧光素做为捕获剂来捕获由辐射分解水产生的羟自由基。绘制出HPF荧光强度和电离辐射剂量之间关系的标准曲线，使用490nm激发光激发HPF，读取荧光强度。比较不同浓度富氢溶液对羟自由基的清除效果。8.羟自由基荧光素在照射前20分子给予小鼠睾丸内注射，照射后迅速取下睾丸，制成冰冻切片观察。使用490nm激发光激发HPF，读取荧光强度，研究富氢溶液对小鼠睾丸内羟自由基的清除效果。9.使用商业化的试剂盒检测睾丸的酶类内源性抗氧化剂（超氧化物歧化酶）、非酶类内源性抗氧化剂（谷光甘肽）和氧化损伤标志产物（丙二醛、蛋白羰基和8羟基脱氧鸟苷）。10.使用微电极插入睾丸内读取数值。无菌条件下，在小鼠下腹部横向切开一个0.5cm的切口，解刨出双侧睾丸。在不同时间段，将氢电极缓缓刺入小鼠睾丸内300μm，检测氢气浓度的变化。再参照已知的标准曲线来确定睾丸内的氢气浓度。实验结果：1.富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐射损伤的防护效应1.1富氢溶液保护受照小鼠精原细胞1.1.1C57BL/6小鼠5Gy全身照射后12小时取双侧睾丸进行HE染色，不正常的精原细胞主要表现为核固缩，给氢组的凋亡发生率明显低于对照组（P<0.05），表明氢气可以缓解辐射诱导的生精细胞的凋亡。1.1.2C57BL/6小鼠5Gy全身照射后12小时取双侧睾丸进行TUNEL染色，TUNEL阳性的细胞只存在于精原细胞和精母细胞中，给氢组的TUNEL阳性率明显低于对照组（P<0.05，P<0.01），表明氢气可以缓解辐射诱导的生精细胞的凋亡。1.2富氢溶液保护受照小鼠精子发生1.2.1照后29天检测睾丸精子头计数，小鼠受到0.5Gy，1.0Gy，2.0Gy和4Gy辐射后，在给氢组精子头计数分别为11.8×107/g,7.0×107/g,4.1×107/g和2.9×107/g，这分别是对照组的1.4倍，1.5倍，1.6倍和1.7倍（P<0.05），是正常组的77.7%,45.9%,27.1%和18.8%。照后56天检测睾丸精子头计数，计算每日精子生成量。小鼠受到5Gy辐射后，给氢气组和WR-2721组小鼠的每日精子生成量显著高于对照组（P<0.05），WR-2721组小鼠的每日精子生成量与给氢气组无显著统计学差异（P>0.05）。1.2.2照后56天检测附睾精子质量，包括精子计数，畸形率计算和活动度计算。小鼠受到5Gy辐射后，给氢气组和WR-2721组小鼠的精子计数（P<0.05），畸形率（P<0.05）和活动度（P<0.05，P<0.01）显著高于对照组，WR-2721组小鼠的精子计数（P>0.05），畸形率（P>0.05）与给氢气组无显著统计学差异，WR-2721组小鼠的精子活动度显著高于给氢气组（P<0.05）。1.3富氢溶液保护辐照后小鼠睾丸组织1.3.1照后29天检测附小鼠睾丸脏器指数，称量小鼠体重和双侧睾丸重量。小鼠受到0.5Gy，1Gy，2Gy和4Gy辐射后，给氢气组小鼠的睾丸脏器指数显著高于对照组（P<0.05）。1.3.2腹腔注射富氢溶液显著改善小鼠睾丸的组织学损伤，照射后29天观察，精子和其它各级生精细胞在一些生精小管中有不同程度的缺失，有些小管中出现了较大的空腔，所有这些改变均被氢气缓解。1.3.35Gy照射35天后检测受照小鼠睾丸小管分化指数，给氢气组和WR-2721组小鼠的睾丸小管分化指数显著高于对照组（P<0.05，P<0.01），WR-2721组小鼠的睾丸小管分化指数显著高于给氢气组（P<0.05）。2.富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐射防护效应的作用机制2.1富氢溶液对羟自由基的清除作用2.1.1在芬顿体系中加入不同浓度富H2溶液，应用5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide （DMPO）捕获由芬顿反应产生的OH。在饱和H2浓度时，反应体系中约有80%左右的羟自由基被清除（P<0.05）。2.1.2羟自由基荧光素荧光强度和电离辐射剂量之间呈明显的线性关系，R2=0.991。在5Gy的剂量下，氢气抑制了88.7%的荧光信号（P<0.01）。2.1.3腹腔注射富氢溶液显著降低小鼠睾丸内的羟自由基水平（P<0.01），照射前20分钟睾丸内注射HPF，照射前5分钟腹腔注射富氢溶液。羟自由基荧光显著的被氢气抑制，但当照射后加氢气时，这种抑制不明显。2.2富氢溶液对受照小鼠睾丸内氧化损伤的影响2.2.1超氧化物歧化酶SOD是细胞内重要的酶类内源性抗氧化剂，还原型谷胱甘肽GSH是细胞内重要的非酶类内源性抗氧化剂，电离辐射通过影响SOD和GSH的结构来使其失活，腹腔注射富氢溶液显著保存小鼠睾丸内SOD的活性和GSH的浓度（P<0.05），提示氢气可以保存内源性抗氧化剂。2.2.2电离辐射与脂质、蛋白质和DNA发生过氧化反应，产生MDA、蛋白羰基和8-OHdG等氧化反应终产物，通过检测照后这些氧化损伤标志产物的浓度，可以评价照后睾丸氧化损伤程度。腹腔注射富氢溶液显著降低小鼠睾丸内MDA、蛋白羰基和8-OHdG的浓度（P<0.05），提示氢气可以缓解内氧化损伤。2.2.3腹腔注射富氢溶液显著提高小鼠睾丸内的氢气浓度，注射5分钟后氢气的浓度在小鼠睾丸内达到峰值，为正常水平的2.8倍（P<0.05），注射10后为正常水平的1.8倍（P<0.05），注射15分钟后恢复正常值（P>0.05）。讨论分析：我们从生精细胞、精子数量质量和睾丸组织学三方面着手研究氢气的辐射防护效应。结果显示，氢气的辐射防护效应表现为氢气对照后生精细胞早期凋亡的抑制，从而在辐照中保存生精细胞活力。凋亡是照后生精细胞缺失的主要方式，我们通过经典的HE组织染色和对凋亡DNA特异的TUNEL染色两种方法，在照后12小时的凋亡发生高峰时间检测睾丸生精细胞，发现氢气显著抑制精原细胞和精母细胞的凋亡。通过睾丸精子头计数和附睾精子质量的检测也证明氢气可以在电离辐射中有效的保护精子发生这一过程。针对睾丸组织的检测中，氢气可以有效提高照后小鼠睾丸脏器指数，睾丸生精小管直径、睾丸组织学评分和睾丸生精小管分化指数等。本研究首次证实了氢气的辐射防护作用与其在活体内清除羟自由基有关，氢气可以做为预防性的抗氧化剂应用于睾丸辐射损伤。在无细胞系统中，不同浓度的富氢溶液显著抑制由芬顿反应产生的DMPO-OH自由基信号。在体内与体外，HPF已经成功的应用于缺血再灌注产生活性氧的检测。我们绘制了HPF荧光强度和电离辐射见的关系，发现二者成比例。因此我们认为HPF可以有效的检测水辐射分解产生的羟自由基。在另外一个无细胞系统中，不同浓度的富氢溶液显著抑制由水辐射分解产生的羟自由基荧光。腹腔注射富氢溶液显著提高小鼠睾丸内的氢气浓度，注射后5分钟氢气浓度达到峰值，所以我们在照射前5分钟给予小鼠氢气。氢气可以显著抑制辐射诱导的氧化HPF荧光，保存内源性抗氧化剂，减轻氧化应激损伤。结论：我们发现氢气可以有效的保护精子生成过程免受电离辐射的影响，氢气的这一作用与其在体内清除羟自由基的能力密不可分。未来，使用氢气也许可以成为在辐射中保存男性生育能力的新奇策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐射损伤的防护效应
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 三、分析讨论
• 第二部分 富氢溶液对雄性小鼠生精细胞辐
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 三、分析讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢