海洋微生物酯酶筛选及性质的研究

论文摘要

酯酶（Esterase,EC3.1.1.1）是重要的工业酶类,是指能够催化水解羧酸酯的所有酶的总称。微生物酯酶在生物转化和动力学拆分等方面具有广阔的应用前景。海洋中有大量产酯酶的微生物,由于其所处环境的特殊性,酯酶也具有更优良的酶学特性。本文从海水和海泥中筛选酯酶产生菌,研究了该菌产酯酶的条件和酯酶的酶学性质,为进一步研究海洋微生物酯酶的结构,酶学特性等作基础研究。在筛选培养基中添加了特异性底物三丁酸甘油酯、橄榄油和指示剂罗丹明B,经初筛和复筛,得到产酯酶活力较高且稳定性较好的菌株,命名为LJ-7。根据形态学和生理生化鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。生长曲线结果表明,Bacillus licheniformis LJ-7的对数期是18h-32h,32h后进入稳定期。优化Bacillus licheniformis LJ-7产酯酶培养基和发酵条件,结果如下：培养基组成（w/v）:牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl10.0,麦芽糖5.0；接种量2%、30℃、培养基初始pH5.5、170r/min发酵45h,酶活力为35.97U/mLBacillus licheniformis LJ-7酯酶经饱和硫酸铵分级沉淀,透析袋浓缩透析除盐,DEAE52纤维素离子交换柱洗脱,收集酶活性峰经SDS-PAGE电泳,酯酶得到纯化,分子量为23.6kDa。研究Bacillus licheniformis LJ-7酯酶的酶学性质,结论如下：（1）酶最适反应温度为40℃；酯酶热稳定性：45℃、50℃、55℃、60℃下保温30min酶活为保存分别为83.20%、71.80%、60.90%、49.80%；（2）酯酶在pH6.2-8.0之间稳定性较好,在碱性环境下稳定性略好于酸性条件；其催化反应的最适pH为8.0；（3）K+和Mn2+对酯酶有强烈的抑制作用,而Cu2+和Fe2+对其促进作用较明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 酯酶简介
• 1.2 酯酶的分类
• 1.2.1 酯酶的标准分类
• 1.2.2 酯酶来源
• 1.2.3 产酯酶的微生物类群
• 1.3 微生物酯酶和脂肪酶的差异
• 1.3.1 催化机理差异
• 1.3.2 催化特性差异
• 1.4 酯酶的应用现状及前景
• 1.4.1 酯酶在合成酯类的应用
• 1.4.2 酯酶在食品中的应用
• 1.4.3 酯酶在药物开发中的应用
• 1.5 国内外研究现状及进展
• 1.6 本课题的立题背景、意义与主要内容
• 1.6.1 立题背景
• 1.6.2 主要研究内容
• 第二章 海洋酯酶产生菌的筛选与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 样品
• 2.1.4 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌株的筛选
• 2.2.1.1 初筛（平板法）
• 2.2.1.2 复筛（摇瓶法）
• 2.2.1.3 酯酶活力测定
• 2.2.2 菌种鉴定
• 2.2.2.1 形态学鉴定
• 2.2.2.2 生理生化特征鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产酯酶菌株的筛选
• 2.3.1.1 初筛结果
• 2.3.1.2 复筛结果
• 2.3.2 细菌鉴定结果
• 2.3.2.1 形态学鉴定结果
• 2.3.2.2 生理生化鉴定结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 BACILUS LICHENIFORMIS LJ-7产酯酶条件的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 原料
• 3.1.2 药品
• 3.1.3 培养基及试剂的配制
• 3.1.4 仪器
• 3.2. 测定方法
• 3.2.1 酯酶活力测定原理
• 3.2.2 芽孢杆菌生长曲线的制作
• 3.2.3 紫外分光光度测酯酶酶活力
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 单因素实验
• 3.3.1.1 摇床转速对产酶的影响
• 3.3.1.2 培养温度对酯酶产量的影响
• 3.3.1.3 培养基初始pH对酯酶产量的影响
• 3.3.1.4 发酵时间对酯酶产量的影响
• 3.3.1.5 接菌量对酯酶产量的影响
• 3.3.1.6 碳源对酯酶产量的影响
• 3.3.2 正交实验
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 生长曲线
• 3.4.2 单因素实验结果
• 3.4.2.1 摇床转速对产酶的影响
• 3.4.2.2 培养温度对产酶影响
• 3.4.2.3 培养基初始pH对产酶的影响
• 3.4.2.4 发酵时间对产酶的影响
• 3.4.2.5 接种量对产酶的影响
• 3.4.2.6 碳源对产酶的影响
• 3.4.3 正交实验实验结果
• 3.4.4 正交实验验证实验
• 3.5 本章小结
• 第四章 BACILLUS LICHENIFORMIS LJ-7酯酶的分离纯化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和培养基
• 4.1.2 主要试剂及仪器
• 4.1.3 酶液的制备
• 4.1.4 酯酶酶活测定
• 4.1.5 蛋白质浓度测定
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 硫酸铵盐析
• 4.2.2 透析
• 4.2.3 DEAE-52纤维素柱层析
• 4.2.4 SDS-PAGE电泳
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 饱和硫酸铵盐析
• 4.3.2 DEAE-52纤维素柱层析
• 4.3.3 SDS-PAGE电泳
• 4.4 本章小结
• 第五章 BACILUS LICHENIFORMIS LJ-7酯酶的酶学性质研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种和培养基
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 酶液的制备
• 5.1.4 酯酶酶活测定
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 酯酶酶促反应的最适反应温度
• 5.2.2 芽孢杆菌酯酶的热稳定性试验
• 5.2.3 酯酶作用最适pH试验
• 5.2.4 酯酶pH稳定性试验
• 5.2.5 金属离子对酯酶酶活的影响
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 酯酶酶促反应最适温度
• 5.3.2 酯酶的热稳定性
• 5.3.3 酯酶酶促反应最适pH
• 5.3.4 酯酶的pH稳定性
• 5.3.5 金属离子对酯酶酶活的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢