黑曲霉A09的F10、G11型木聚糖酶表达规律研究

论文摘要

木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖,在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木聚糖酶及木聚糖酶基因的研究是当前酶学研究热点之一,目前研究主要集中在菌种、产酶条件优化及基因克隆表达方面的研究,而从mRNA水平和酶学水平分析不同培养基成分和不同培养时间对木聚糖酶表达量影响的分子机理,目前还很少有人进行研究。本研究利用不同碳氮源培养黑曲霉A09(Aspergillus niger A09)诱导产酶,通过木聚糖酶活性测定、木聚糖酶F10和G11的酶谱分析,以及木聚糖酶cDNA相对定量分析和半定量分析,获得以下试验结果:(1)黑曲霉A09的F10和G11两型木聚糖酶基因在不同碳源中表达差异研究:在所用碳源中木聚糖和木糖是木聚糖酶F10、G11表达的强诱导物,葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖的诱导作用一般,阿拉伯糖和乳糖在培养基中的存在阻遏两基因的表达。当木聚糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖和纤维二糖作为碳源时,F10基因的表达量都低于G11基因。结合分析比较,选择木聚糖为最佳碳源。(2)黑曲霉A09的F10和G11两型木聚糖酶基因在不同氮源中表达差异研究:当酵母膏提取物、草酸铵、硝酸铵和硫酸铵作为氮源时,两型木聚糖酶的表达量都比较大,相比较而言,硝酸铵的作用效果最强,而蛋白胨、尿素、硝酸钠阻遏两基因的表达。当酵母膏提取物、草酸铵、硝酸铵和硫酸铵作为氮源时,F10基因的表达量都低于G11基因。由此确定选择性诱导培养黑曲霉A09分泌G11木聚糖酶的最适培养方案为木聚糖加硝酸铵。(3)黑曲霉A09的两型木聚糖酶在不同生长阶段的表达差异的研究:在(1)(2)试验中优化的诱导条件的基础上所研究的产酶时程规律表明:随着时间的延长,两型木聚糖酶的表达量逐渐提高,从而使蛋白质的合成量得到提高,当培养到60h时表达量达到最大,随后两型木聚糖酶的表达量随着时间的增长而逐渐降低。无论在任何时间点,G11基因的表达量都高于F10基因,因此可以确定选择性诱导培养黑曲霉A09分泌G11木聚糖酶的最适培养时间为60h。

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 木聚糖与木聚糖酶
• 1.1.1 木聚糖及其结构
• 1.1.2 木聚糖酶
• 1.2 木聚糖酶的产生菌种
• 1.3 木聚糖酶的分类
• 1.4 木聚糖降解酶系统的催化机制
• 1.5 木聚糖酶的诱导合成
• 1.6 木聚糖酶的生产
• 1.6.1 天然菌种发酵生产
• 1.6.2 工程菌生产木聚糖酶
• 1.6.3 固定化菌体生产木聚糖酶
• 1.7 木聚糖酶的生产影响因素
• 1.8 木聚糖酶的应用
• 1.9 木聚糖酶应用中存在的问题及研究方向
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 菌种
• 3.2 主要仪器
• 3.3 主要试剂
• 3.4 培养基
• 3.4.1 斜面培养基
• 3.4.2 产酶培养基
• 3.5 单孢子悬液制备
• 3.6 液体产酶培养
• 3.7 粗酶液的制备
• 3.8 木聚糖酶活力的测定
• 3.9 生物量的测定
• 3.10 菌丝体的获得
• 3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.12 酶谱的检测电泳
• 3.13 总 RNA 的提取
• 3.14 RNA 的纯度和完整性分析
• 3.15 cDNA 的合成
• 3.16 电泳检测
• 3.17 引物设计
• 3.18 半定量 RT-PCR 对黑曲霉诱导产木聚糖酶的分析
• 3.18.1 半定量 RT-PCR 程序设置
• 3.18.2 结果检测
• 3.19 实时 PCR
• 3.19.1 PCR 程序设置
• 3.19.2 应用 SYBR Green 方法对不同条件下两基因表达进行分析
• 4 结果与分析
• 4.1 黑曲霉 A09 的木聚糖酶 F10 和 G11 在不同碳源中表达规律的研究
• 4.1.1 黑曲霉 A09 在不同碳源下的生长及产酶的情况
• 4.1.2 RNA 的纯度和完整性分析
• 4.1.3 RT-PCR 法检测 F10 和 G11 表达情况
• 4.1.4 用 Real-time PCR 法分析黑曲霉 A09 的 F10 和 G11 木聚糖酶在不同碳源中表达差异
• 4.1.4.1 黑曲霉 A09 的 18SrRNA、F10 和 G11 的融解曲线
• 4.1.4.2 黑曲霉 A09 的 18SrRNA、F10 和 G11 基因的扩增曲线分析
• 4.1.4.3 不同碳源下黑曲霉 A09 的木聚糖酶 F10 和 G11 基因相对表达量差异
• 4.2 黑曲霉 A09 的木聚糖酶 F10、G11 基因在不同氮源中表达规律的研究
• 4.2.1 黑曲霉 A09 在不同氮源下的生长及产酶的情况
• 4.2.2 RNA 的纯度和完整性分析
• 4.2.3 RT-PCR 法检测 F10 和 G11 表达情况
• 4.2.4 用 Real-time PCR 法分析黑曲霉 A-09 木聚糖酶 F10 和 G11 在不同氮源中基因表达差异
• 4.2.4.1 黑曲霉 A-09 的 18SrRNA、F10 和 G11 基因的扩增曲线分析
• 4.2.4.2 黑曲霉 A-09 在不同氮源下木聚糖酶基因 F10 和 G11 的表达量差异
• 4.3 黑曲霉 A09 的 F10 和 G11 木聚糖酶在不同生长阶段表达差异的研究
• 4.3.1 黑曲霉 A09 在不同培养阶段的生长及产酶的情况
• 4.3.2 RNA 的纯度和完整性分析
• 4.3.3 RT-PCR 法检测 F10 和 G11 表达情况
• 4.3.4 用 Real-time PCR 法分析黑曲霉 A09 木聚糖酶 F10 和 G11 在不同生长阶段基因表达差异
• 4.3.4.1 黑曲霉 A09 的 18SrRNA、F10 和 G11 基因的扩增曲线分析
• 4.3.4.2 培养 A09 不同生长阶段 F10 和 G11 基因的相对表达量差异
• 4.3.5 酶谱检测分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• Abstract