生防枯草芽孢杆菌mRNA差异显示分析

论文摘要

枯草芽孢杆菌是一种重要的生物拮抗菌,在植物病害生物防治方面具有突出贡献。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Zh-2、Zh-4、Zh-6、Zh-18菌株是黑龙江省科学院微生物研究所基因工程室分离、鉴定并保存的4株重要生防菌。这些菌株形态、生理生化特性相同,而抑菌能力和抑菌谱不同。为了从分子水平区分这些菌株和快速克隆功能性新基因,本文首次采用mRNA差异显示分析技术,从分子水平探讨各个菌株之间的差异,寻找和分离其差异表达基因片段,为各个菌株建立一个分子档案,以区别各个菌株,同时,对特异表达基因的研究也有助于我们挖掘和利用优良基因,为快速克隆功能性新基因提供一种技术方法。本项研究采用TaKara RNAiso Reagent法提取枯草芽孢杆菌总RNA,选择MICROBExpress TM Bacterial mRNA Enrichment Kit（Ambion）试剂盒富集mRNA,根据枯草芽孢杆菌基因组DNA GC含量与大肠杆菌基因组DNA GC含量具有相似性,从文献中选择11条随机引物对4株枯草芽孢杆菌进行mRNA差异显示分析,结果表明用这些随机引物进行PCR扩增,获得了77个差异片段。选择5个差异片段测序后进行了生物信息学分析。来自于Zh-4菌株的S-1序列片段长750bp,经过生物信息学分析,该序列片段与来自枯草芽孢杆菌菌株168的相关基因序列有84%的相似性,编码产物名称是假定蛋白（hypothetical protein）。但该序列片段的功能目前还不清楚。来自于Zh-4菌株的S-2序列片段长462bp,经过生物信息学分析,该序列片段与来自枯草芽孢杆菌菌株168的16SrRNA有99%的相似性。来自于Zh-4菌株的S-3序列片段长度414bp,经过生物信息学分析,该序列片段与来自枯草芽孢杆菌168菌株的序列（检索号:ref|NP387945.1|）有84%的相似性,编码产物名称是磷酸丝氨酸酶（serine phosphatase）,其余的一部分相似序列所代表的功能均与孢子形成II期有关,剩余的相似序列来源于BAC库的测序结果。但该序列片段的功能目前还不清楚。来自于Zh-18菌株的S-4序列片段长418bp,氨基酸序列比对检索与S-3序列片段相同,但2个序列的核苷酸序列不同。S-4序列片段的功能也未知。来自于Zh-18菌株的S-5序列片段长222bp,经过生物信息学分析,该序列片段与来自短小芽孢杆菌菌株SAFR-032 （gb│cp000813.1│）有95%的相似性,相似序列功能是编码核糖核酸酶R。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 生防枯草芽孢杆菌的研究概况
• 1.1.1 枯草芽孢杆菌概述
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌用于植物病害防治的研究概况
• 1.1.3 枯草芽孢杆菌在植物病害防治方面存在的问题和措施
• 1.2 原核生物的mRNA 差异显示分析
• 1.2.1 mRNA 差异显示分析
• 1.2.2 原核生物mRNA 差异显示分析的一般方法
• 1.2.3 原核生物mRNA差异显示分析中随机引物的选择
• 1.2.4 原核生物的mRNA 差异显示的应用实例
• 1.3 RNA 规则
• 1.3.1 RNase 的性质
• 1.3.2 常用的RNase 抑制剂
• 1.3.3 创造一个无RNase 的环境
• 1.4 本实验的研究内容和意义
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 研究意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的活化
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌对病原真菌的抑菌效果
• 2.2.3 枯草芽孢杆菌总RNA 的提取
• 2.2.4 mRNA 的富集
• 2.2.5 随机引物的设计和选择
• 2.2.6 随机引物的验证
• 2.2.7 枯草芽孢杆菌 mRNA 差异片段的序列统计
• 2.2.8 枯草芽孢杆菌 mRNA 差异片段的序列测定
• 2.2.9 差异片段的 BLAST 比对和生物信息学分析
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 4 株枯草芽孢杆菌对不同病原菌的抑菌差异
• 3.2 随机引物的设计合成
• 3.2.1 根据枯草芽孢杆菌 168 菌株基因组信息设计随机引物
• 3.2.2 文献中选择随机引物的 PCR 扩增
• 3.3 总RNA 的提取
• 3.4 mRNA 的富集
• 3.4.1 mRNA 富集的原理
• 3.4.2 枯草芽孢杆菌mRNA 的富集
• 3.5 枯草芽孢杆菌总 RNA 的 RAP-PCR
• 3.6 部分差异片段的统计及选取差异片段的序列测定
• 3.7 差异片段的生物信息学分析
• 3.7.1 差异片段 S-1 的生物信息学分析
• 3.7.2 测序片段S-2 的生物信息学分析
• 3.7.3 测序片段S-3 的生物信息学分析
• 3.7.4 测序片段S-4 的生物信息学分析
• 3.7.5 测序片段S-5 的生物信息学分析
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文