溶藻弧菌噬菌体、菌影疫苗及其对对虾免疫保护性的比较研究

论文摘要

本论文从自然环境中分离,筛选了一株致病弧菌,经鉴定为溶藻弧菌,并同时从环境当中分离了它的噬菌体。本文研究了噬菌体的生理特性,制作溶藻弧菌菌影。并利用全菌疫苗,菌影疫苗及噬菌体注射对虾,比较它们对南美白对虾免疫功能的影响和对对虾溶藻弧菌弧菌病的防治效果。具体研究结果如下:1.本文从虾塘水体中分离了一株溶藻弧菌,对该菌进行了常规的生理生化鉴定,确认该菌为溶藻弧菌;2.以分离到的溶藻弧菌为宿主菌从虾塘水体中分离了一株溶藻弧菌噬菌体。平板上噬菌斑特征:噬菌斑较为透明,圆整,边缘清楚,无晕环。噬菌斑较小,直径为1.0～1.2mm。进行扩增之后该噬菌体的最高效价可达1010pfu/mL;3.测定了溶藻弧菌噬菌体的生理生化特性,实验结果表明:噬菌体的RTD为106pfu/mL。最适pH为8.0,太酸或者太碱的环境都不适合噬菌体的生存;最适温度为35℃,具有有较好的耐热性,对60℃以上的温度敏感;对紫外线敏感,溶藻弧菌和噬菌体混合时间影响出斑数量;该噬菌体对氯仿不敏感,但其对非离子去垢剂Triton-X100敏感,经处理后滴度剩余17.8%;Mg2+有利于噬菌体的吸附,比不添加的出斑率高出55～71个百分点。在盐度为25‰的情况下,对溶藻弧菌的裂解能力最强,这可能是因为这株噬菌体是在海水环境下分离出来的有关,所以对于高盐度的耐受性比较好;该噬菌体的最佳感染复数为在0.110之间;噬菌体的潜伏期为35min;4.本文探索了如何能用噬菌体尽量完全的裂解宿主,由实验结果可以看出:溶藻弧菌的培养时期对于噬菌体的除菌效果是有影响的,噬菌体对于培养了2小时到8小时之间的宿主菌的裂解能力相当,宿主菌数量的变化规律也一致,都是刚开始有微弱的升高,到了4小时以后开始下降,6小时后下降更加明显,当达到一个最低点后,又有升高;噬菌体对于培养了10个小时的菌的裂解能力相比培养了2小时到8小时之的菌的裂解能力有所降低,在噬菌体和宿主菌反应时间到10小时时,菌的数量就达到了最低值,但这个最低值高于噬菌体和培养了2小时到8小时之间的宿主菌相互反应所达到的最低值;用培养时期在12小时以后的溶藻弧菌作为宿主时,结果发现噬菌体对菌的数量变化作用比较小。菌数量的变化曲线接近于菌的生长曲线;但当噬菌体数和溶藻弧菌数之间的比不同时,弧菌的数量变化规律也不同,当弧菌数量比噬菌体数多时,菌数量是先呈现上升趋势,然后下降,再上升;当噬菌体数量比较多时,菌的数量先下降,后缓慢上升,当MIO=10时,除菌效果最好,噬菌体数和溶藻弧菌数之间的比对除菌效果影响不是很大,只是会导致到达菌数量最少的时间点不同;5.实验结果发现在实验室中,噬菌体不能完全裂解细菌,使用100μL的大蒜液或浓度为100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的PBS就可以把经噬菌体裂解剩下的菌除干净;6.用溶藻弧菌对南美白对虾进行攻毒实验。结果表明,肌注射1×106cfu/mL的溶藻弧菌可以使对虾的死亡率达到30%,而1×107cfu/mL的溶藻弧菌可导致成虾红体病,1×108cfu/mL的溶藻弧菌可使对虾的死亡率达到90%。各实验组凡纳滨对虾的各部分的弧菌含量都远比对照组高,肝胰脏和肠内的含菌量尤其多;对虾的血细胞数目呈升高趋势;7.本实验给南美白对虾注射甲醛处理的全菌疫苗,噬菌体处理的菌影疫苗和噬菌体,比较三者对对虾的免疫学指标的影响。经噬菌体处理过的菌影疫苗注射的对虾的NOS活力最高,注射噬菌体对NOS活力的影响不是很明显,甚至低于阴性对照组;注射了108pfu/mL全菌疫苗的南美白对虾在12h的PO值最高。注射了108pfu/mL噬菌体的南美白对虾的血蓝蛋白在6h的含量最高;8.免疫后攻毒实验结果可以看出,108pfu/mL噬菌体对南美白对虾的免疫保护率最好,可以达到88.2%,随着浓度的降低,免疫保护率也随之下降,但106pfu/mL的噬菌体对南美白对虾仍有70.6%的免疫保护率,高于108cfu/mL的全菌疫苗。108cfu/mL菌影疫苗的免疫保护率也有76.5%高于108的全菌疫苗。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 溶藻弧菌研究概况
• 1.1.1 溶藻弧菌对水产养殖业的危害
• 1.2.2 溶藻弧菌对人类健康的危害
• 1.1.3 溶藻弧菌的致病性
• 1.1.4 弧菌病的防治
• 1.2 噬菌体及其生物防治
• 1.2.1 噬菌体及其对宿主的裂解
• 1.2.2 噬菌体应用的研究进展
• 1.2.3 噬菌体生物防治的特点
• 1.2.4 应用噬菌体生物防治的发展趋势
• 1.3 研究目的及意义
• 2 溶藻弧菌及其噬菌体的分离
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 菌用培养基及药品、试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品来源
• 2.2.2 溶藻弧菌的分离鉴定
• 2.2.3 溶藻弧菌噬菌体的分离
• 2.3 结果
• 2.3.1 溶藻弧菌的分离鉴定
• 2.3.2 溶藻弧菌噬菌体的分离
• 2.4 讨论
• 3 溶藻弧菌噬菌体生物学特性的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 噬菌体
• 3.1.3 培养基及药品、试剂
• 3.1.4 主要实验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 噬菌体的常规稀释度（RTD）测定
• 3.2.2 不同pH 值下噬菌体的裂解活性
• 3.2.3 噬菌体最适温度的测定
• 3.2.4 噬菌体的热稳性实验
• 3.2.5 噬菌体的紫外线灭活实验
• 3.2.6 噬菌体和细菌的混合时间对裂解率的影响
• 3.2.7 氯仿、去污剂及蛋白酶 K 对噬菌体活性的影响
• 3.2.8 细菌培养时期对裂解率的影响
• 2+对裂解率的影响'>3.2.9 Mg²⁺对裂解率的影响
• 3.2.10 盐度对裂解率的影响
• 3.2.11 噬菌体最佳感染复数的测定
• 3.2.12 一步生长曲线的绘制
• 3.3 结果
• 3.3.1 噬菌体的常规稀释度（RTD）测定
• 3.3.2 不同pH 值下噬菌体的裂解活性
• 3.3.3 噬菌体最适温度的测定
• 3.3.4 噬菌体的热稳性实验
• 3.3.5 噬菌体的紫外线灭活实验
• 3.3.6 噬菌体和细菌的混合时间对裂解率的影响
• 3.3.7 氯仿、去垢剂及蛋白酶K 对噬菌体活性的影响
• 3.3.8 细菌培养时期对裂解率的影响
• 2+对裂解率的影响'>3.3.9 Mg²⁺对裂解率的影响
• 3.3.10 盐度对裂解率的影响
• 3.3.11 噬菌体最佳感染复数的测定
• 3.3.12 一步生长曲线的绘制
• 3.4 讨论
• 4 利用噬菌体制作菌影
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 噬菌体
• 4.1.3 培养基及药品
• 4.1.4 主要实验仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 溶藻弧菌与溶藻弧菌噬菌体的检测
• 4.2.2 利用噬菌体裂解宿主菌
• 4.2.3 利用大蒜液消除残余活菌
• 4.2.4 利用抗生素消除残余活菌
• 4.3 结果
• 4.3.1 利用噬菌体裂解宿主菌
• 4.3.2 利用大蒜液消除残余活菌
• 4.3.3 利用抗生素消除残余活菌
• 4.4 讨论
• 5 菌影疫苗、全菌疫苗及噬菌体的免疫保护性
• 5.1 材料
• 5.1.1 宿主菌株
• 5.1.2 噬菌体
• 5.1.3 实验对象
• 5.1.4 实验地点
• 5.1.5 培养基及试剂
• 5.1.6 实验仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 实验条件
• 5.2.2 南美白对虾攻毒实验
• 5.2.3 全菌疫苗、菌影疫苗及噬菌体的制备
• 5.2.4 全菌疫苗、菌影疫苗及噬菌体对南美白对虾免疫功能的影响
• 5.2.5 免疫后攻毒
• 5.2.6 血液中各指标的测定
• 5.2.7 免疫保护率
• 5.2.8 数据的处理
• 5.3 结果
• 5.3.1 南美白对虾攻毒实验
• 5.3.2 一氧化氮合成酶（NOS）的变化
• 5.3.3 血蓝蛋白的变化
• 5.3.4 PO 活力的测定
• 5.3.5 免疫后攻毒结果
• 5.4 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介