橄榄离体种质保存及其分子机制的研究

论文摘要

橄榄是我国南方著名特产果树。本试验以不同橄榄品种为材料，进行橄榄花药愈伤组织诱导、幼胚培养与成熟胚培养等离体培养研究及橄榄试管苗离体种质保存研究，然后从橄榄品种惠圆试管苗的叶片中克隆多酚氧化酶基因PPO和叶绿素a-b结合蛋白基因Cab，并对橄榄试管苗保存过程中PPO基因和Cab基因的转录水平进行表达研究。主要研究结果如下：1橄榄离体培养①橄榄花药愈伤组织的诱导以橄榄品种惠圆的花蕾为材料，研究不同消毒方法对花蕾的影响及不同培养基配方对橄榄花药愈伤组织诱导的影响。结果表明，橄榄花药消毒的最佳方法是：采用0.1%HgCl2消毒8min。MS+2.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT+5.0mg·L-1AgNO3较适宜作为橄榄花药愈伤组织的诱导。②橄榄幼胚的培养及试管苗获得以3个橄榄品种惠圆、长营、自来圆为试验材料，分别对其幼胚的萌发、试管苗的增殖培养进行研究。结果表明，橄榄品种的差异和幼胚大小导致幼胚萌发率不同；不同的光照强度对橄榄幼胚的萌发率有一定影响，不同的取材时间对橄榄幼胚的萌发率影响相对较大。添加30g·L-1蔗糖的1/2MS培养基中橄榄幼胚的萌发率最高。适宜作为3个橄榄品种试管苗的增殖培养基是MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，橄榄侧芽萌发率最高。③橄榄成熟胚培养与试管苗获得以橄榄品种惠圆为试验材料，从不同光照时间，不同质量浓度蔗糖及四因素三水平正交设计不同因素（6-BA、IBA、KT、蔗糖）对橄榄侧芽诱导的影响。结果表明，光照时间12h·d-1的有效侧芽数最多，培养基中蔗糖质量浓度为30g·L-1和40g·L-1时，植株诱导有效侧芽数相对较多。在多因素试验中，在MS附加30g·L-1蔗糖、0.5mg·L-16-BA、0.5mg·L-1IBA、0.5mg·L-1KT的培养基最适合诱导橄榄侧芽，橄榄诱导有效侧芽数最高。2橄榄试管苗离体种质保存研究本试验首次对橄榄试管苗离体种质保存方法进行探讨，研究了不同培养基对橄榄试管苗离体保存的影响。适宜作为橄榄试管苗种质资源离体保存的培养基是MS+30g·L-1蔗糖，当12个月不继代时，试管苗的存活率还很高，能达到88.35%。以此基础上，对56份橄榄种质资源进行离体保存。试验还对已保存1.5年的橄榄种质资源生长状况进行观察，研究发现不同橄榄种质资源之间的生长状况有一定差异。3橄榄试管苗保存过程中PPO基因的克隆及荧光定量PCR表达分析以橄榄品种惠圆的试管苗为试验材料，首次采用同源克隆和RACE的方法从橄榄试管苗叶片克隆得到PPO基因家族的一个成员片段为376bp，与其它物种的同源性高达95%以上，基因命名为PPO1，登录号为JF811036。同时克隆得到PPO基因cDNA全长序列，该PPO cDNA全长为1934bp，其中包含13bp的5’UTR，102bp的3’UTR，3′端还含有24bp的poly（A）尾。与不同物种间PPO基因核苷酸同源性都比较高，橄榄PPO开放阅读框（ORF）有1818碱基组成，编码606氨基酸，ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。将此基因命名为PPO2，并在GenBank上登录，登录号为JQ319005。对橄榄试管苗PPO2基因的生物信息学分析得到PPO2蛋白分子式为C3079H4741N835O897S20；分子量为68448.7Da，等电点是8.47，属于碱性蛋白；对其亲疏水性进行分析，表明是亲水蛋白；进行同源蛋白家族比较，发现PPO2基因的开放阅读框606个氨基酸残基编码的蛋白质属于Tyrosinase超级家族成员；橄榄PPO2基因属于非分泌蛋白不存在信号肽；PPO2蛋白可能在N-端内形成由外向内的跨膜螺旋结构；亚细胞定位表明该蛋白存在于线粒体的基质可能性最大；可能发生磷酸化修饰的氨基酸位点有30个；橄榄PPO2蛋白在氨基酸序列492-519区域最有可能形成卷曲螺旋；橄榄PPO2蛋白二级结构由15.02%的α螺旋、14.85%的延伸链和70.13%的不规则卷曲组成；三级结构预测表明橄榄试管苗PPO2蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲组成；这些分析结果为研究橄榄试管苗保存过程中PPO2的作用奠定了重要基础。从橄榄基因组DNA中克隆到PPO2基因，没有内含子。对橄榄试管苗不同保存阶段材料PPO2基因的mRNA转录表达进行研究，结果表明，橄榄试管苗保存1个月幼叶比较多, PPO2基因的表达量相对最高;保存2、3月时随着叶的成熟PPO2基因表达量下降;保存4个月时，随着侧芽的萌发PPO2基因表达量迅速上升，5个月急剧下降;保存6个月时侧芽生长旺盛，幼叶增多，PPO2基因表达量又急剧上升;保存7个月稍有下降;保存8月时，橄榄试管苗有衰老迹象，PPO2基因表达量上升。PPO2基因很可能在橄榄试管苗发育过程中发挥重要作用。4橄榄试管苗Cab基因的克隆及荧光定量PCR表达分析本试验首次以橄榄品种惠圆的试管苗叶片为材料，从其mRNA中克隆了Cab基因。采用同源克隆方法，对比其它已知的Cab基因序列，设计一对引物扩增3’RACE，获得大小为676bp的核苷酸片段，其中3’UTR为135bp，3′端还含有11bp的典型的poly（A）结构；经blast比对发现橄榄Cab基因与其它物种的Cab基因同源性很高，达到90%，据此设计了一对直接克隆橄榄Cab基因ORF的引物；结果Cab基因ORF大小为792bp，编码264个氨基酸；Cab基因cDNA全长946个核苷酸序列编码264个氨基酸，GENBANK的登录号为：JN661689。对Cab基因编码的蛋白进行了生物信息学分析，Cab蛋白由264个氨基酸组成；分子式为C1282H1949N329O364S11，相对分子质量为28147.2Da；等电点为5.29，属于酸性蛋白；表现为亲水性；进行同源蛋白家族比较，发现Cab基因的开放阅读框264个氨基酸残基编码的蛋白质属于Chloroab-bind超级家族成员。Cab蛋白不含有信号肽，在N-端内，有两处由内向外的跨膜螺旋结构；Cab定位于过氧化物酶体的可能性最大；橄榄Cab蛋白在6个Ser、2个Thr、2个Tyr氨基酸位点发生磷酸化修饰；橄榄Cab基因编码的蛋白可能没有形成卷曲螺旋；橄榄Cab蛋白二级结构由29.17%的α螺旋、10.23%的延伸链和60.61%的不规则卷曲组成；Cab蛋白的三维结构主要由α螺旋和不规则卷曲组成，这种三级结构是橄榄Cab蛋白行使生物学功能的基础。从橄榄基因组DNA中克隆到Cab基因，没有内含子。对橄榄试管苗不同保存阶段材料Cab基因的mRNA转录表达进行研究，结果表明，橄榄试管苗保存1个月幼叶比较多Cab基因的表达量相对最高，同时保存1个月的MS培养基的橄榄试管苗Cab基因的表达量很低，保存2、3月时随着叶的成熟Cab基因表达量下降，保存4个月时，随着侧芽的萌发Cab基因表达量稍有上升，保存5个月急剧下降，保存6个月时侧芽生长旺盛，幼叶增多，Cab基因表达量稍有上升，保存7个月稍有下降，保存8月时，橄榄试管苗有衰老迹象，Cab基因表达量急剧上升。5橄榄试管苗保存过程中PPO酶活性变化本试验对橄榄品种惠圆试管苗保存过程中PPO酶活性变化进行研究，分析PPO基因在蛋白水平上的表达。结果表明，橄榄试管苗分别保存1、2、3、4、5个月时PPO活性趋势不明显，保存时间6、7、8个月时PPO活性急剧增加。分析橄榄试管苗保存8个月时不同橄榄品系的PPO活性的差异，研究表明，不同的橄榄品系PPO活性明显不同，长营C（184）、橄榄284、梅埔七粒尺（M141）和黄大长营（M167）的PPO活性明显高于其它8个品系。总之，本论文较为全面和系统地研究了橄榄离体培养及其种质离体保存，同时研究了PPO、Cab基因与橄榄离体保存的相关性。首次克隆了橄榄试管苗PPO、Cab基因，填补了橄榄PPO、Cab基因克隆的空白。并对PPO、Cab基因进行了定量分析，建立了橄榄实时荧光定量PCR技术；且以PPO酶的活性变化作为橄榄PPO蛋白表达指标，这些都为橄榄离体种质保存过程的分子机制奠定了基础。

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Abstract

第一章引言

1 植物种质资源保存研究进展

1.1 植物离体保存研究的优势

1.2 植物离体保存方法简介

1.2.1 常规组织培养技术保存法

1.2.2 限制生长保存法

1.2.3 超低温保存法

2 植物多酚氧化酶基因和叶绿素a-b结合蛋白基因研究进展

2.1 植物多酚氧化酶基因研究概况

2.1.1 多酚氧化酶在植物中的分布及亚细胞定位

2.1.2 植物多酚氧化酶基因的结构与特性

2.1.3 植物多酚氧化酶基因的生理功能

2.1.4 植物多酚氧化酶基因的表达

2.2 植物叶绿素a-b结合蛋白基因研究进展

2.2.1 植物叶绿素a-b结合蛋白基因的克隆

2.2.2 植物光系统捕光色素蛋白复合体的类型及功能

3 橄榄种质资源的离体保存

3.1 橄榄种质资源保存研究进展

3.2 橄榄离体培养研究进展

3.2.1 茎尖培养

3.2.2 幼胚培养

3.2.3 成熟胚培养

3.3 橄榄分子生物学研究进展

3.3.1 DNA和RNA的提取

3.3.2 分子标记

3.3.3 基因克隆

4 本研究的意义和内容

4.1 本研究的意义

4.2 本研究的内容

第二章橄榄离体培养

第一节橄榄花药愈伤组织的诱导

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 培养条件

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对橄榄花药消毒效果的影响

2.2 不同培养基配方对橄榄花药愈伤组织诱导的影响

3 讨论

3.1 橄榄花药愈伤组织的诱导的难点

3.2 诱导橄榄花药愈伤组织的关键因素是2,4-D

第二节橄榄幼胚培养与试管苗获得

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理

1.2.2 影响3个橄榄品种幼胚萌发的因素

1.2.3 3个橄榄品种试管苗的增殖培养

1.3 培养条件

2 结果与分析

2.1 影响3个橄榄品种幼胚萌发的因素

2.1.1 不同幼胚类型对3个橄榄品种萌发的影响

2.1.2 不同光照强度对3个橄榄品种萌发的影响

2.1.3 不同MS浓度和蔗糖含量对3个橄榄品种萌发的影响

2.1.4 不同取材时间对3个橄榄品种萌发的影响

2.2 3个橄榄品种试管苗的增殖培养

3 讨论

3.1 3个橄榄品种幼胚培养反应类似

3.2 6-BA是橄榄侧芽诱导的关键因素

第三节橄榄成熟胚培养与试管苗获得

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 不同光照时间对橄榄侧芽诱导的影响

2.2 不同质量浓度蔗糖对橄榄侧芽诱导的影响

2.3 四因素三水平正交设计不同因素对橄榄侧芽诱导的影响

3 讨论

3.1 光照和蔗糖在橄榄侧芽诱导中起关键作用

3.2 植物生长调节物在橄榄侧芽诱导中的作用

第三章橄榄试管苗离体种质保存研究

第一节橄榄试管苗离体种质保存方法初探

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

1.3 培养条件

2 结果与分析

2.1 不同培养基对橄榄试管苗离体保存的影响

2.2 不同成熟度胚对橄榄试管苗离体保存的影响

3 讨论

第二节橄榄试管苗离体种质保存

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

1.3 培养条件

2 结果与分析

2.1 56份橄榄种质资源的成熟胚萌发

2.2 长期保存的橄榄种质资源生长情况

3 讨论

3.1 成熟胚作为橄榄离体种质保存启动材料的探讨

3.2 不同基因型种质资源试管苗的保存

3.3 橄榄离体种质保存的现实意义

第四章橄榄试管苗 PPO 和 Cab 基因克隆及生物信息学分析

第一节橄榄试管苗 PPO 基因克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

1.1.2 供试菌种

1.1.3 仪器和试剂

1.2 方法

1.2.1 橄榄试管苗总 RNA 和DNA的提取方法

1.2.2 橄榄试管苗PPO基因cDNA保守区第一次的克隆

1.2.3 橄榄试管苗PPO基因第二次保守区扩增

1.2.4 橄榄试管苗 PPO 基因 cDNA 的 3′RACE

1.2.5 橄榄试管苗PPO基因的cDNA的5′RACE扩增

1.2.6 序列拼接

1.2.7 橄榄试管苗PPO基因cDNA开放阅读框（ORF）克隆

1.2.8 全长基因序列分析

1.2.9 橄榄试管苗PPO2基因的生物信息学分析

1.2.10 橄榄试管苗PPO2基因DNA的克隆

2 结果与分析

2.1 橄榄试管苗总 RNA 和叶片基因组DNA的提取纯度及含量检测

2.2 橄榄试管苗PPO第一次cDNA保守区的克隆

2.3 橄榄试管苗PPO第二次cDNA保守区的克隆

2.4 橄榄试管苗PPO基因的cDNA的 3′RACE 克隆结果

2.5 橄榄试管苗PPO基因的cDNA的 5′RACE 克隆结果

2.6 橄榄试管苗PPO基因全长序列拼接结果

2.7 橄榄试管苗PPO2基因cDNA开放阅读框（ORF）的克隆

2.8 橄榄试管苗PPO2基因序列分析

2.9 橄榄试管苗PPO2基因的生物信息学分析

2.9.1 PPO2蛋白理化性质的分析

2.9.2 PPO2保守结构域预测及同源蛋白家族比较

2.9.3 橄榄PPO2蛋白质信号肽的预测和分析

2.9.4 橄榄PPO2蛋白的跨膜结构预测及分析

2.9.5 橄榄PPO2蛋白亚细胞定位预测与分析

2.9.6 橄榄PPO2蛋白磷酸化位点预测

2.9.7 橄榄PPO2蛋白质的功能基序分析

2.9.8 橄榄PPO2蛋白卷曲螺旋预测

2.9.9 橄榄PPO2蛋白进二级结构预测及分析

2.9.10 橄榄PPO2蛋白质三维结构预测

2.9.11 橄榄PPO2系统进化树

2.10 橄榄试管苗基因组 DNAPPO2基因全长的 PCR 扩增结果

3. 讨论

3.1 克隆橄榄试管苗PPO基因的难点分析

3.2 橄榄试管苗PPO基因通过磷酸化方式调节氧化作用

3.3 橄榄PPO基因的特性及其功能域分析

第二节橄榄试管苗Cab基因克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 橄榄试管苗Cab基因cDNA的 3′RACE 克隆结果

2.2 橄榄试管苗Cab基因cDNA的 ORF 克隆结果

2.3 橄榄试管苗Cab的cDNA全长的拼接序列

2.4 橄榄试管苗Cab基因序列分析

2.5 橄榄试管苗Cab基因的生物信息学分析

2.5.1 Cab蛋白理化性质的分析

2.5.2 Cab保守功能域预测及同源蛋白家族比较

2.5.3 橄榄试管苗Cab蛋白信号肽预测

2.5.4 橄榄试管苗Cab蛋白质跨膜区结构预测

2.5.5 橄榄试管苗Cab蛋白亚细胞定位预测与分析

2.5.6 橄榄试管苗Cab蛋白磷酸化位点预测

2.5.7 橄榄Cab蛋白质的功能基序（motif）分析

2.5.8 橄榄Cab蛋白质卷曲螺旋预测

2.5.9 橄榄试管苗Cab蛋白二级结构预测

2.5.10 橄榄试管苗Cab蛋白质三维结构预测

2. 5.11 橄榄Cab系统进化树

2.6 橄榄试管苗基因组 DNA 的Cab基因克隆

3 讨论

3.1 橄榄Cab基因cDNA全长和 DNA 全长的获得

3.2 橄榄Cab基因的功能

第五章橄榄试管苗保存过程中 PPO2 和Cab基因的荧光定量 PCR 表达分析

第一节橄榄试管苗保存过程中基因 PPO2 荧光定量表达分析

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试剂和仪器

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 橄榄试管苗不同保存阶段下培养物总RNA提取

2.2 荧光实时 PCR 扩增参照基因和PPO2基因的参数分析

2.3 橄榄试管苗保存过程中PPO2基因的相对定量表达分析

3 讨论

3.1 PPO基因与幼嫩组织的启动分化有关

3.2 橄榄试管苗离体保存过程相关基因PPO的作用

第二节橄榄试管苗保存过程中基因 Cab 荧光定量表达分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂和仪器

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 荧光实时 PCR 扩增 Cab 基因的参数分析

2.2 橄榄试管苗保存过程中 Cab 基因相对定量表达分析

3 讨论

3.1 Cab 基因在橄榄试管苗保存过程中的表达

3.2 Cab、PPO 与植物光合作用的关系

第六章橄榄试管苗保存过程中PPO酶活性变化

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 不同保存阶段下PPO活性的变化

2.2 不同橄榄品系的PPO活性差异比较

3 讨论

3.1 橄榄试管苗离体保存过程PPO酶活性总体呈上升趋势

3.2 橄榄试管苗离体保存过程PPO转录水平和酶活变化比较分析

第七章小结

1 橄榄离体培养

1.1 橄榄花药愈伤组织的诱导

1.2 橄榄幼胚培养与试管苗获得

1.3 橄榄成熟胚培养与试管苗获得

2 橄榄试管苗离体种质保存研究

3 橄榄试管苗保存过程中PPO基因的克隆及荧光定量 PCR 表达分析

4 橄榄试管苗Cab基因的克隆及荧光定量PCR表达分析

5 橄榄试管苗保存过程中 PPO 酶活性变化

参考文献

附录

附录1 图版及图版说明

附录2 橄榄试管苗 PPO 基因（cDNA）序列登陆GenBank信息

附录3 橄榄试管苗 Cab 基因（cDNA）序列登陆GenBank信息

致谢

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