新型季铵盐壳聚糖纳米载药体系的研究

论文摘要

对天然多糖壳聚糖进行了改性,制备了一种能溶于中性水的壳聚糖衍生物N,N,N-三甲基壳聚糖盐酸盐（TMC）。根据分别带有正、负电荷的聚电解质溶液发生复凝聚的原理,使用TMC溶液与带负电荷的羧甲基壳聚糖（CMC）及肝素（Hep）溶液,分别制备了两种新型的纳米粒子TMC/CMC、TMC/Hep载药体系。使用红外光谱、激光散射仪、透射电镜、原子力显微镜等手段对制备的纳米粒子形成条件、纳米粒子的粒径、粒径分布、表面电位、表面形貌、pH值及离子浓度的稳定性等进行了表征。结果表明:该纳米粒子大致为球形,粒径在150～600 nm之间,粒径分布很窄,表面通常带正电荷。粒径和表面电位可以通过改变制备条件来调节。探讨并优化了TMC/CMC、TMC/Hep两种纳米粒子作为药物载体的制备条件,考察了影响药物包封率、体外释放行为的因素。结果显示,两种纳米粒子在负载药物后粒径减小。两种纳米粒子对牛血清蛋白、阿霉素的包封能力均与TMC浓度、TMC季铵化程度等因素相关;包封率和包封量可以通过改变影响因素来调节。体外释放结果显示,两种纳米载药体系均显示出初期释放快速,后期释放缓慢的特点。释放速率也可以调节。阿霉素的体外释放曲线与一级动力学模型和Ritger-Pappas模型的拟合精度较高。用MTT法考察了游离阿霉溶液和负载阿霉素的纳米粒子溶液对HepG2细胞的抑制作用和在小鼠体内的药物代谢动力学行为。结果表明,阿霉素包封于纳米粒子后活性没有降低,可在更长的时间内更有效地作用于癌细胞。与游离阿霉素溶液相比,负载阿霉素的TMC/Hep纳米粒子溶液在小鼠血液中的半衰期延长,在肝脏和脾脏的分布增加,而在心脏中的浓度降低。为了考察纳米粒子被细胞摄取的过程以及体内分布,在TMC上接枝了异硫氰酸荧光素（FITC）,并以此制备了TMC-g-FITC/CMC,TMC-g-FITC/Hep两种新型的纳米粒子荧光探针。考察了HepG 2细胞摄取纳米粒子的影响因素,用激光共聚焦显微镜观察了HepG 2细胞对纳米荧光探针对的摄取过程,经小鼠尾静脉注射观察其在体内的分布。结果表明,HepG2细胞对这两种纳米荧光探针的摄取能力与TMC浓度、细胞培养的温度相关,随时间延长,纳米粒子向细胞核聚集。小鼠体内实验显示,该纳米粒子有一定的肝靶向性。评价了TMC及其纳米粒子对质粒DNA（pDNA）的负载及保护能力,考察了其纳米复合物对HepG 2细胞的转染能力。结果表明,TMC12.11与pDNA的质量比为10:1时,在48 h达到最高的转染效率。而TMC/CMC、TMC/Hep纳米粒子对pDNA的载体保护能力增强,但对HepG2细胞的最高转染效率出现在72h。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 纳米载药体系的基质材料
• 1.2 壳聚糖基纳米粒子的制备方法
• 1.2.1 共价交联法
• 1.2.2 离子交联法
• 1.2.3 聚电解质复合法
• 1.2.4 化学改性自组装法
• 1.2.5 沉淀析出法
• 1.2.6 乳化交联法
• 1.2.7 喷雾干燥法
• 1.2.8 模板聚合法
• 1.2.9 乳滴聚结法
• 1.3 壳聚糖纳米体系作为载体的应用
• 1.3.1 运载抗肿瘤药的壳聚糖纳米控释体系
• 1.3.2 运载核苷酸的壳聚糖纳米载药体系
• 1.3.3 运载多肽和蛋白类药物的壳聚糖纳米控释体系
• 1.3.4 运载抗原或疫苗的壳聚糖纳米载药体系
• 1.3.5 运载眼科和鼻腔药物的壳聚糖纳米控释体系
• 1.3.6 运载中枢神经系统药物的壳聚糖纳米载药体系
• 1.3.7 运载抗生素及消炎药的壳聚糖纳米载药体系
• 1.4 本课题的研究意义和主要研究内容
• 第二章 新型季铵盐壳聚糖纳米载药粒子的制备与性能
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 原料与试剂
• 2.1.2 TMC的合成及其纳米粒子的制备
• 2.1.2.1 TMC的合成
• 2.1.2.2 TMC/CMC、TMC/Hep纳米粒子的制备
• 2.1.2.3 负载BSA纳米粒子的制备
• 2.1.3 TMC及其纳米粒子的表征
• 2.1.3.1 TMC的核磁共振氢谱
• 2.1.3.2 特性粘数测定
• 2.1.3.3 红外光谱测定
• 2.1.3.4 纳米粒子的粒径分析
• 2.1.3.5 纳米粒子的形态观察
• 2.1.4 纳米粒子对PH和离子浓度稳定性的表征
• 2.1.5 纳米粒子对牛血清蛋白的包封
• 2.1.6 牛血清蛋白的释放
• 2.1.7 数据处理
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 三甲基壳聚糖盐酸盐的合成与表征
• 2.2.1.1 三甲基壳聚糖盐酸盐的合成
• 2.2.1.2 三甲基壳聚糖盐酸盐的核磁共振谱
• 2.2.1.3 TMC的红外谱图
• 2.2.1.4 特性粘数
• 2.2.2 TMC/CMC纳米粒子的制备与载药性能
• 2.2.2.1 TMC/CMC纳米粒子及负载牛血清蛋白纳米粒子的制备
• 2.2.2.2 TMC/CMC纳米粒子的红外光谱图
• 2.2.2.3 TMC/CMC/BSA的红外光谱图
• 2.2.2.4 TMC/CMC纳米粒子的形成条件
• 2.2.2.5 TMC/CMC纳米粒子的表征
• 2.2.2.6 纳米粒子对pH和离子浓度的稳定性
• 2.2.2.7 TMC/CMC纳米粒子对牛血清蛋白的包封
• 2.2.2.8 牛血清蛋白的体外释放
• 2.2.3 TMC/HEP纳米粒子的制备及负载牛血清蛋白的性能
• 2.2.3.1 TMC/Hep纳米粒子的制备
• 2.2.3.2 TMC/Hep纳米粒子的红外光谱图
• 2.2.3.3 TMC/Hep/BSA红外光谱图
• 2.2.3.4 TMC/Hep纳米粒子的形成条件
• 2.2.3.5 纳米粒子尺寸和形态的表征
• 2.2.3.6 TMC/Hep纳米粒子对pH值和离子浓度的稳定性
• 2.2.3.7 TMC/Hep纳米粒子对牛血清蛋白的包封
• 2.2.3.8 牛血清蛋白的体外释放
• 2.3 结论
• 第三章 新型纳米荧光探针的制备及体内分布的研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 原料与试剂
• 3.1.2 TMC-G-FITC的合成与纳米荧光探针的制备
• 3.1.2.1 溶液的配制
• 3.1.2.2 TMC-g-FITC的合成
• 3.1.2.3 纳米荧光探针的制备
• 3.1.3 TMC-G-FITC及纳米荧光探针的表征
• 3.1.3.1 红外光谱测定
• 3.1.3.2 FITC标记率
• 3.1.3.3 纳米荧光探针的表征
• 3.1.3.4 光漂白实验
• 3.1.4 细胞的毒性测定
• 3.1.5 体外摄取实验
• 3.1.5.1 TMC剂量对细胞摄取的影响
• 3.1.5.2 培养温度对细胞摄取的影响
• 3.1.5.3 培养时间对细胞摄取的影响
• 3.1.6 动态观察细胞对纳米粒子荧光探针的摄取
• 3.1.7 纳米粒在小鼠体内各组织中的分布
• 3.1.7.1 样品的制备
• 3.1.7.2 组织回收率
• 3.1.7.3 纳米荧光探针在小鼠体内的分布
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 TMC-G-FITC样品的合成与表征
• 3.2.2 纳米粒子荧光探针的制备与表征
• 3.2.3 光漂白实验
• 3.2.4 TMC-G-FITC纳米粒子荧光探针的细胞毒性
• 3.2.5 细胞对纳米粒子的摄取
• 3.2.6 纳米粒子对细胞的渗透与扩散
• 3.2.7 纳米荧光探针在小鼠体内的分布
• 3.3 结论
• 第四章 新型负载阿霉素纳米粒子的制备及其性能
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 原料与试剂
• 4.1.2 纳米粒子的制备
• 4.1.3 纳米粒子的表征
• 4.1.4 纳米粒子对阿霉素的包封
• 4.1.4.1 DOX标准曲线的绘制
• 4.1.4.2 载药量的测定
• 4.1.4.3 正交试验
• 4.1.5 阿霉素的体外释放
• 4.1.6 纳米粒子对细胞的抑制性能
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 纳米粒子的制备
• 4.2.2 纳米粒子的表征
• 4.2.3 纳米粒子对阿霉素的包封及制备条件的优选
• 4.2.4 阿霉素的体外释放
• 4.2.4.1 阿霉素的体外释放
• 4.2.4.2 纳米粒子的体外药物释放模型
• 4.2.5 TMC的细胞毒性
• 4.2.6 负载阿霉素的纳米粒子对细胞的抑制作用
• 4.3 结沦
• 第五章 负载阿霉素的纳米粒子在小鼠体内的分布
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 原料与试剂
• 5.1.2 样品预处理
• 5.1.3 纳米在小鼠各组织回收率的测定
• 5.1.4 方法回收率与精密度检测
• 5.1.5 药物及载药纳米粒经小鼠尾静脉给药后的各组织分布
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 阿霉素和负载阿霉素的纳米粒在小鼠体内的回收率
• 5.2.2 精密度
• 5.2.3 药物代谢动力学参数计算
• 5.2.4 阿霉素在小鼠体内的分布
• 5.3 结论
• 第六章 季铵盐壳聚糖及其纳米粒子作为基因载体的研究
• 6.1 实验部分
• 6.1.1 原料与试剂
• 6.1.2 TMC/PDNA纳米粒子的制备与表征
• 6.1.2.1 溶液的配制
• 6.1.2.2 TMC/pDNA纳米粒子的制备
• 6.1.2.3 TMC纳米粒与pDNA的结合实验
• 6.1.2.4 TMC/pDNA纳米粒子的表征
• 6.1.3 TMC及其纳米粒子对PDNA的包封与保护作用
• 6.1.3.1 琼脂糖凝胶电泳
• 6.1.3.2 DNA结合滞留分析
• 6.1.3.3 不同季铵化程度的TMC对pDNA的包裹作用
• 6.1.3.4 TMC纳米粒子对pDNA的保护作用
• 6.1.3.5 DNase Ⅰ消化试验
• 6.1.4 TMC/PDNA纳米粒的细胞毒性
• 6.1.5 TMC/PDNA纳米粒对细胞的转染
• 6.1.5.1 脂质体-pDNA转染复合物的制备
• 6.1.5.2 TMC/pDNA纳米粒的制备
• 6.1.5.3 TMC/CMC/pDNA、TMC/Hep/pDNA纳米粒的制备
• 6.1.5.4 转染方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 TMC/PDNA纳米粒的制备
• 6.2.2 TMC/PDNA纳米粒的表征
• 6.2.3 TMC及其纳米粒子对质粒的包封
• 6.2.4 TMC对质粒DNA的包封与保护作用
• 6.2.5 细胞毒性
• 6.2.6 TMC/PDNA转染细胞
• 6.3 结论
• 结论与展望
• 1 结论
• 2 研究工作的不足及今后努力的方向
• 参考文献
• 研究生期间发表论文
• 致谢