P2X7受体介导的小胶质细胞形态变化和受体表达的研究

论文摘要

嘌呤受体分为P1和P2两大类。P1受体主要由腺苷（A）激活,P2受体主要由核苷酸激活,包括三磷酸腺苷（ATP）。P2受体根据其作用机理的不同又可以分为P2X和P2Y受体。P2Y受体家族（P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11-13）是一类代谢型的与G-蛋白相偶联的受体,与磷脂酶C的激活和三磷酸肌醇的形成有关。P2X受体家族是一类对钾、钠和钙可通透的离子型配体门控通道。目前已经克隆出7个不同的P2X亚型,分别称为P2X1-7,P2X7又称P2Z。P2X7受体特性与其他六个亚型不同:体外电生理实验表明ATP短暂刺激该受体即可引起非选择性小阳离子瞬时通透;如果ATP反复或持续刺激该受体即可引起非选择性质膜孔道开放,最终导致细胞凋亡。P2受体广泛分布于机体各组织器官,目前认为小胶质细胞上表达有多种嘌呤受体亚型,包括P2X7、P2Y2和P2Y12。这表明ATP可能对小胶质细胞有重要的调节作用。细胞外ATP可以通过P2X受体激活胶质细胞。在体内,细胞外ATP浓度很低,不足以激活胶质细胞,表达更多的P2X受体;而细胞内ATP浓度较高,后者是前者的1000倍,达毫摩尔水平。在某些病理条件下如脑外伤、缺血、炎症等局部细胞受到损伤而释放出大量ATP及降解产物,这些物质在局部浓度增高,并逐渐向邻近区域扩散,较长时间刺激损伤区及其邻近区的胶质细胞。这足以激活胶质细胞,并使P2X受体表达上调。小胶质细胞激活后肥大、增生,形成典型的吞噬细胞,可产生许多生物活性物质如活性氧、一氧化氮、蛋白酶及一些炎性物质对周围细胞产生损害作用;但另一方面又产生转化因子beta 1和神经生长因子等物质促进神经组织再生及修复。活化的小胶质细胞在脑外伤、缺血、炎症、AIDS、多发性硬化病、蛋白病毒病、退行性病变如Alzheimer及Parkinson病以及衰老等过程中有着很重要的作用。尽管上述病理过程均与小胶质细胞活化有关,但小胶质细胞被激活的机制还不太清楚。综合本研究和以往文献资料,P2X7参与小胶质细胞的激活和凋亡效应。如果用特异性拮抗剂阻断ATP的作用,将阻止小胶质细胞和星型胶质细胞激活后所带来的对周围组织细胞的损害作用和胶质疤痕的形成,从而保护脑组织不受进一步的损害或有利于神经纤维的再生。为了研究P2X7受体介导的小胶质细胞的形态变化和受体表达情况,我们利用原代培养的新生大鼠小胶质细胞进行实验。取新生1-2 d SD大鼠的脑组织（去脑膜）,含10%胎牛血清的DMEM培养基培养10-15 d,恒温摇床轻柔转动15 min取悬浮细胞,十二孔板铺片20 min换液培养过夜。分别用0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L浓度的ATP刺激小胶质细胞1 h,福尔马林固定后加入第一抗体1:500稀释和ED-1抗体,湿盒中暗处室温放置过夜,加入稀释的Cyc3标记的驴抗兔IgG 1:5000稀释,室温放置1 h。Hoechst核染色2 min,荧光显微镜下观察。ED-1标记的细胞占所有细胞99%以上,表明我们原代培养的用于实验的小胶质细胞纯度很高,可以满足实验要求。细胞在不同浓度ATP的刺激下,其形态逐渐发生了变化,细胞的伪足逐渐消失,细胞逐渐收缩变圆,P2X7受体的表达量也随着ATP浓度的增加而增加。该实验结果表明在P2X7受体的介导下,原代培养的小胶质细胞在ATP刺激下,细胞形态逐渐发生变化,受体表达也逐渐增加,持续的ATP刺激还会导致小胶质细胞的凋亡。在细胞外ATP的作用下,P2X7受体可能参与了小胶质细胞的活化和凋亡的过程。为了进一步验证ATP对P2X7受体的作用,我们用P2X7受体的激动剂ATP和特异性拮抗剂oATP作用于原代小胶质细胞,通过流式细胞技术来确定P2X7受体是否在小胶质细胞凋亡中起作用。两组原代小胶质细胞分别加入3 mmol/L ATP和3 mmol/L ATP+0.1 mmol/L oATP作用15 min、30min、60min、90 min和120 min,Annexin V/PI双标染色,流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。统计检验分析显示,ATP组和拮抗剂组的凋亡和死亡百分率存在显著差异,这表明P2X7受体确实参与了小胶质细胞的激活和凋亡过程。由于原代培养的小胶质细胞表达多种嘌呤受体,除了P2X7受体外,还有P2Y2和P2Y12等受体,为了排除其他受体对P2X7受体介导的小胶质细胞形态变化和受体表达的影响,我们首次使用大鼠P2X7受体基因（GB号X95882）与EGFP基因融合构建了真核表达重组质粒pcDNA3-hi-EGFP-rP2X7。在此基础上,转染人HEK293细胞,使用G418作为筛选剂,在0.8 mg/ml浓度下,经过单克隆化,建立了稳定表达P2X7受体和EGFP的HEK293细胞的细胞株,经胞外ATP刺激的功能分析和免疫组织化学等测试,该细胞株正确表达P2X7受体并稳定传代50代以上。根据文献资料可以知道,以往的实验没有用ATP刺激单独表达P2X7受体的单克隆细胞模型来分析细胞的形态变化和受体表达情况。本研究利用实验室构建的单独表达P2X7受体的人HEK293细胞株,分别用0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.4mmol/L和0.8 mmol/L浓度的ATP去刺激在十二孔板中过夜培养在盖玻片上的HEK293细胞,处理时间为1 h,福尔马林固定后第一抗体1:500稀释,湿盒中暗处室温放置过夜,Cyc3标记的驴抗兔第二抗体1:5000稀释后,湿盒中暗处室温放置1 h,封片显微镜下观察。经ATP刺激的表达P2X7受体的HEK293细胞的形态发生明显的变化,从低浓度ATP刺激组到高浓度ATP刺激组原本多边形的细胞形态逐渐变圆,在细胞膜上表达的P2X7受体也随着浓度的增加其表达量也逐渐增多。这表明ATP确实是P2X7受体的激动剂,并且在不同浓度的ATP作用下,通过单一的P2X7受体可以引起细胞的形态变化和受体表达的变化。在ATP持续刺激下,会导致细胞的凋亡。而且由于是ATP刺激单独表达P2X7受体的单克隆细胞模型,这也在一定程度上排除了其他嘌呤受体对ATP刺激后产生反应的干扰。本研究通过ATP刺激原代培养的小胶质细胞,研究P2X7受体介导的细胞形态变化和受体表达情况,并且通过流式细胞技术来研究P2X7受体介导的ATP对小胶质细胞凋亡的影响。为了排除其他嘌呤受体对P2X7受体的影响,我们首次通过建立单独表达P2X7受体的单克隆细胞模型,对ATP作用下P2X7受体介导细胞形态变化和受体的表达进行了分析,确认了P2X7受体介导ATP激活和诱导小胶质细胞的作用,有助于进一步研究P2X7受体信号通路及其下游过程。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 P2X7 受体介导的原代小胶质细胞形态变化和受体表达
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 第二部分 P2X7 受体拮抗剂对小胶质细胞的影响
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 第三部分 单克隆化的稳定转染 P2X7 受体的 HEK293 细胞模型的建立
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 第四部分 P2X7 受体介导的 HEK293 细胞的形态变化和受体表达
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 总结
• 综述 小胶质细胞被 ATP 激活后释放纤溶酶原和细胞因子的机制和意义
• 致谢