水稻MAPKKs基因功能鉴定和microRNAs靶模拟材料构建

论文摘要

干旱是全球范围内农业生产面临的严峻问题,是农作物生产的重要制约因素。在农业用水紧缺的今天,对水稻这样需水量大的农作物进行抗旱品质改良显得尤为重要。MAPK级联途径是生物体中一种重要的信号转导途径,并且在真核生物中高度保守。拟南芥中MAPK基因被发现在极端温度、干旱、盐分和激素等刺激下都能迅速改变表达水平。本试验对6个水稻MAPKK基因进行表达谱分析,并对本实验室已获得的部分MAPKK超表达转基因水稻进行抗逆鉴定,初步推测其在抗逆方面的功能。miRNA靶模拟（target mimicry）是在拟南芥中发现的一种抑制miRNAs功能的机制。通过水稻MPSS数据库挑选出部分对ABA有响应的miRNAs,克隆其靶模拟基因,并构建超表达载体转化日本晴,获得了miRNA靶模拟遗传材料。主要结果如下：1.用Affymetrix芯片分析水稻OsMKK在珍汕97、明恢63和汕优63三个水稻品种在27个不同表达时期和组织中及KT、GA3、NAA三种激素处理的表达谱。结果发现,OsMKK5雄蕊和幼穗中表达最高；OsMKK10-1整体表达量很低,但是雄蕊和胚乳中表达高；在KT、GA3和NAA三种激素处理下,OsMKK在三叶期的三个品种中表达量均呈现轻度上升,但都未超过2倍。2..利用反转录定量PCR方法分析了水稻MAPKK家族中OsMKK1、OsMKK3、OsMKK4、OsMKK5、OsMKK6和OsMKK10-2等6个基因在不同的非生物逆境处理下的表达量变化。除OsMKK10-2之外,其他基因不同程度地受到多种逆境的诱导上升表达。说明本研究的A/B/C亚家族的MKK基因均为非生物胁迫正调控。3.本实验室已经获得了的OsMKK1、OsMKK3、OsMKK4、OsMKK6和OsMKK10-2转基因T2代植株,检测转基因植株的表达量。结果表明5个基因的转基因植株中该基因的表达量明显升高,但其中OsMKK4表达量升高不明显。4.对OsMKK3和OsMKK10-2转基因水稻进行了苗期模拟非生物胁迫处理。实验结果发现,150mM浓度甘露醇处理下,转基因植株均在株高和鲜重方面明显比对照非转基因植株高,这说明超表达OsMKK3和OsMKK10-2能够改善苗期水稻在渗透下的营养生长。5.在三叶期用30%的PEG6000对OsMKK1、OsMKK3、OsMKK6和OsMKK10-2转基因水稻胁迫处理24h,然后复水后生长7d。实验结果发现,在非转基因植株枯萎死亡的情况下,OsMKK1、OsMKK3转基因株系恢复情况最好,这表明OsMKK1、OsMKK3能提高水稻的复原抗旱性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 1 前言
• 1.1 引言
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 MAPK级联途径
• 1.2.1.1 MAPK级联途径的组成
• 1.2.1.2 植物体中MAPKKKs研究进展
• 1.2.1.3 植物体中MAPKs研究进展
• 1.2.1.4 MAPKKs的研究进展
• 1.3 miRNAs及miRNAs的靶基因模拟
• 1.3.1 miRNAs的发现
• 1.3.2 miRNAs的合成
• 1.3.3 miRNAs功能研究
• 1.3.4 miRNAs功能研究方法进展
• 1.3.5 miRNAs靶模拟的作用机制
• 1.3.6 基因模拟在拟南芥miRNAs功能验证上的应用
• 1.4 GATEWAY技术构建表达载体的原理
• 1.5 研究目的
• 2 材料和方法
• 2.1 水稻材料
• 2.2 菌株、载体和感受态细胞
• 2.3 试剂及常用仪器
• 2.4 MIRNAs靶模拟基因克隆
• 2.4.1 PCR扩增OsIPS1基因序列
• 2.4.2 构建OsPS1的T载体
• 2.4.3 PCR扩增miRNAs靶模拟基因
• 2.5 遗传转化载体的构建和转化
• 2.5.1 Gateway技术构建超表达载体
• 2.5.2 遗传转化
• 2.6 构建OsMKK进化树
• 2.7 OsMKK芯片表达谱
• 2.8 CTAB法提取植物基因组DNA
• 2.9 CTAB大样法抽提DNA及SOUTHERN BLOT分析
• 2.9.1 CTAB大样法抽提DNA
• 2.9.2 Southern blot
• 2.10 RNA抽提
• 2.11 RNA反转录
• 2.12 表达量分析
• 2.13 OsMKK基因功能初步鉴定
• 2.13.1 OsMKK在非生物逆境下的表达量分析
• 2.13.2 OsMKK转基因植株芽期逆境胁迫
• 2.13.2.1 OsMKK转基因水稻甘露醇模拟干旱实验
• 2.13.2.2 OsMKK转基因水稻耐盐性实验
• 2.13.2.3 OsMKK转基因水稻水稻芽期ABA敏感性实验
• 2.13.3 OsMKK转基因植株PEG干旱模拟
• 3 结果与分析
• 3.1 OsMKK家族的进化树
• 3.2 OsMKK基因芯片表达谱分析
• 3.3 OsMKK基因在激素处理后的表达分析
• 3.4 OsMKK转基因植株在非生物逆境下的分析
• 3.5 OsMKK转基因植株拷贝数和表达量的检测
• 3.5.1 OsMKK转基因植株拷贝数检测
• 3.5.2 OsMKK转基因植株表达量检测
• 3.6 OsMKK转基因植株芽期抗逆实验
• 3.6.1 OsMKK转基因植株芽期甘露醇胁迫分析
• 3.6.2 OsMKK转基因水稻芽期盐胁迫分析
• 3.6.3 OsMKK转基因植株对ABA敏感性分析
• 3.7 OsMKK转基因水稻苗期PEG干旱模拟实验
• 3.8 可能与抗旱相关的MIRNAs的筛选
• 3.9 靶模拟基因的克隆
• 3.9.1 OsIPS1基因克隆
• 3.9.2 MIM1862的克隆
• 3.10 遗传转化载体的构建和转化
• 3.10.1 遗传转化载体的构建
• 3.10.2 农杆菌介导的水稻转化
• 4 讨论
• 4.1 OsMKK5可能与花器官发育有关
• 4.2 OsMKK1和OsMKK3可能是与抗旱有关的基因
• 4.3 OsMKK能够参与多种非生物胁迫
• 4.4 OsMKK4与抗病性相关
• 参考文献
• 致谢
• 附录PROTOCOLS