N～+注入选育高产复合酶益生菌及其机理的研究

论文摘要

以本实验室筛选并保存的一株产复合酶益生菌黑曲霉 ANO1 为出发菌株,经 N+多次注入并辅以紫外线复合诱变处理,结合平板透明圈法定向选育,得到高产变异菌株 ANO2。结果显示,出发菌株 ANO1酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活分别由原来的 71.6 IU.g-1、141.7 IU.g-1和 264.8 IU.g-1相继提高到 996.5 IU.g-1、940.4 IU.g-1和 906.5 IU.g-1。变异菌株 ANO2经传 5 代培养,产酶特性稳定;利用单因素搜索和正交试验摸索出了 ANO2最佳产酶条件:培养基最佳营养为麸皮 426.8,玉米芯 341.45g,豆粕 341.45g,氯化铵 17.07g,水 1000mL,接种量为 10%;pH 5.5,30℃培养 4 天,。结果提示,N+注入可能是一种有效的产酶益生菌选育方法。 通过对 N+注入黑曲霉孢子的生物学效应研究发现:真空处理对活细胞有明显伤害,黑曲霉孢子的存活率随着放入真空中时间的延长而呈下降趋势,但随着放置时间的延长孢子的存活率下降速率有所缓慢;同样,孢子存活率也是随着注入剂量加大而迅速降低,但当注入剂量加大到 20×2.6×1014N+/cm2 时存活率出现平缓回升,注入剂量超过 50×2.6×1014 N+/cm2时存活率又再次开始下降;注入剂量越大,刨子突变率越高,中等注入剂量（20-60）×2.6×1014N+/cm2可引起较高的正突变率;ESR 谱研究结果表明,N+注入前和注入后都有自由基 ESR 波谱单一峰,且波峰的位置相同,随着注入剂量的增大,孢子内的自由基 ESR 波谱的强度也逐渐增大;SEM 观察发现,未经 N+注入的孢子较为完整、饱满且表面光滑,而经注入后的孢子孢子表面粗糙,可见明显的刻蚀损伤和破壁现象,并且注入剂量越大,伤痕也越深宽。 通过比较原菌株 ANO1和变异菌株 ANO2生长特性的研究发现:原始菌株 ANO1和变异菌株 ANO2同时接种单菌落于含有麸皮汁的平板培养基中,变异菌株 ANO2在平板培养基上生长缓慢,35 h 才出现针尖状菌落,而原菌株 25 h 就出现了针尖状的菌落。但变异菌株 ANO2形成孢子的时间相对较早,有明显透明圈出现,菌褶出现较早;变异菌株 ANO2的生物量和产酶量呈相关性上升。而原始菌株 ANO1的生物量在72h 之前是呈上升趋势,而在 72-96h 之间原菌株 ANO1 的生物量却有一个平台期,随后开始下降。原菌株 ANO1酶活虽上升不高,但主要是在生物量稳定后开始上升的。

论文目录

• 综述
• 1 低能离子生物学的发展
• 1.1 低能离子生物学产生
• 1.2 低能离子作用机理
• 1.3 低能离子束生物学的应用
• 2 饲用酶的研究
• 2.1 国际饲用酶的发展
• 2.2 国内饲用酶的发展
• 2.3 饲用酶制剂的种类
• 2.4 饲用酶制剂的发展趋势与前景
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 出发菌株
• 1.2 溶液与试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 高产菌株筛选流程
• 2.2 筛选谱系
• 2.3 菌株的分离纯化
• 2.4 酶活测定
• 2.5 测定三种酶酶活的标准曲线绘制
• 2.6 离子注入
• 2.7 紫外线照射
• 2.8 菌种筛选方法
• 2.9 粗酶液的制备
• 2.10 孢子存活率的测定
• 2.11 孢子突变率的测定
• 2.12 扫描显微电镜（SEM）观察样品制备
• 2.13 电子顺磁共振（ESR）测定
• 2.14 培养基正交试验设计
• 2.15 生物量的测定
• 结果与分析
• +注入黑曲霉的生物学效应'>1 N⁺注入黑曲霉的生物学效应
• +注入对黑曲霉孢子刻蚀损伤显微观察'>1.1 低能N⁺注入对黑曲霉孢子刻蚀损伤显微观察
• +注入对黑曲霉孢子内自由基含量的影响'>1.2 低能N⁺注入对黑曲霉孢子内自由基含量的影响
• 1.3 真空对黑曲霉孢子存活率的影响
• 2 低能离子注入诱变参数的确定
• +注入能量对孢子存活率和正突变率的影响'>2.1 N⁺注入能量对孢子存活率和正突变率的影响
• +注入剂量对孢子存活率和正突变率的影响'>2.2 N⁺注入剂量对孢子存活率和正突变率的影响
• 2.3 紫外线照射对孢子的存活率和正突变率的影响
• 3 复合酶菌株黑曲霉的诱变和选育
• 3.1 筛选结果
• 2产酶稳定性研究'>3.2 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶稳定性研究
• 2产酶发酵优化'>4 黑曲霉变异菌株 ANO₂产酶发酵优化
• 2产酶发酵培养基优化'>4.1 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶发酵培养基优化
• 2产酶发酵培养条件优化'>4.2 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶发酵培养条件优化
• 4.3 培养基正交试验
• 5. 菌株生物学特性的研究
• 5.1 菌株形态观察
• 1和变异菌株ANO₂发酵过程中生物量变化'>5.2 原菌株ANO₁和变异菌株ANO₂发酵过程中生物量变化
• 讨论
• +注入黑曲霉的生物学效应'>1. N⁺注入黑曲霉的生物学效应
• +注入对黑曲霉孢子刻蚀损伤显微观察'>1.1 低能N⁺注入对黑曲霉孢子刻蚀损伤显微观察
• +注入对黑曲霉孢子内自由基含量的影响'>1.2 低能N⁺注入对黑曲霉孢子内自由基含量的影响
• 1.3 靶室真空时间对孢子存活率的影响
• 2 低能离子注入诱变参数的确定
• +注入能量对孢子存活率和正突变率的影响'>2.1 N⁺注入能量对孢子存活率和正突变率的影响
• 2.2 子注入剂量对孢子存活率和正突变率的影响
• 2.3 紫外线照射存活曲线和正突变率的影响
• 3. 复合酶菌株黑曲霉的诱变和选育
• 2产酶发酵优化'>4. 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶发酵优化
• 2产酶发酵培养基优化'>4.1 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶发酵培养基优化
• 2产酶发酵培养条件优化'>4.2 黑曲霉变异菌株ANO₂产酶发酵培养条件优化
• 5. 菌株生物学特性的研究
• 5.1 菌株形态观察
• 1和变异菌株ANO₂发酵过程中生物量变化'>5.2 原菌株ANO₁和变异菌株ANO₂发酵过程中生物量变化
• 结论
• 参考文献
• 致谢和作者简介