猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和非结构蛋白Npro、NS4A的原核表达及纯化

论文摘要

猪瘟又称为猪霍乱（hog cholera, HC）,在欧洲则被称为古典猪瘟（Classical swine fever, CSF）。猪瘟是一种高度接触性传染病,由猪瘟病毒Classical swine fever virus, CSFV)所引起。具有高度的接触传染性,流行范围广泛,发病时间段频繁,死亡率高等特点,对养猪业危害十分严重。猪瘟多年以来一直是猪病防治研究的重点,是世界动物卫生组织需报告的疾病之一,也是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。CSFV隶属黄病毒科瘟病毒属,是瘟病毒属成员之一,基因组共编码4个结构蛋白（衣壳蛋白C、三个糖蛋白E0、E1、E2）以及至少8个非结构蛋白（按照排列顺序分别为Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。猪感染猪瘟病毒后能够产生针对结构蛋白E2、E0和非结构蛋白NS2、3蛋白的抗体,但针对非结构蛋白NS2、3的抗体不能用于猪瘟的鉴别及诊断。原核表达系统具有表达量较高,成本较低,易于操作等优点,是表达和重组蛋白生产的优先选择体系。本实验采用原核表达的方法,采用融合表达载体pGEX-6P-1表达CSFV系列基因。pGEX-6P-1属于高效原核表达载体,已应用该质粒成功表达多种蛋白,其结构包括tac强启动子序列,带有Amp+抗性基因,并且具有谷胱甘肽巯基转移酶标签（GST-Tag）,该标签分子量大小为26KDa。在蛋白质纯化过程中,亲和标签扮演着非常重要的角色,有助于增强蛋白质稳定的稳定性并促进其溶解。本实验的目的是为了探索表达和鉴定猪瘟病毒蛋白的方法,实验克隆了CSFV石门株中Npro、E0、E2、NS4A共4个基因,插入pGEX-6P-1表达载体中,构建了4个原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测发现,4个重组质粒pGEX-6P-1-E2、pGEX-6P-1-E0、pGEX-6P-1-Npro及pGEX-6P-1-NS4A均得以成功表达。在不同诱导条件下进行比较,为大量表达CSFV编码蛋白研究其结构和功能打下基础。实验使用超声法破碎菌体获得蛋白,发现E2、NS4A全部以包涵体形式表达,Npro和E0在上清和包涵体里均得到表达,但E0大部分为包涵体表达。实验应用变性剂尿素溶解包涵体,通过改变其浓度对包涵体进行变性和重折叠。尿素对包涵体的氢键具有较强的而且为可逆的变性作用,微观状态下,通过离子间的相互作用,破坏了包涵体蛋白质分子内以及分子间的各种化学键,使多肽得以伸展。在溶解包涵体时,加入Tris,对促进蛋白质的复性有积极影响；而包涵体溶解液和洗涤液中的EDTA则可以有效防止融合蛋白降解。将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中Npro为上清中的可溶性蛋白,E0、E2,NS4A为变性后复性的包涵体。将纯化后的蛋白进行Western-blot检测反应原性。Western-blot检测实验结果发现原核表达后产生的重组蛋白Npro不能与CSFV阳性血清反应,而E2重组蛋白能够被CSFV阳性血清识别。本研究应用了原核表达系统,用亲和层析的方法纯化了猪瘟病毒结构蛋白E0,E2和非结构蛋白Npro, NS4A。实验在原核中表达了CSFV E0、E2, Npro和NS4A基因,纯化了带有GST标签的融合蛋白Npro,E2,而E2经过测定具有反应原性。本实验通过猪瘟病毒结构蛋白E0,E2和非结构蛋白Npro,NS4A的研究,归纳出了一套表达和鉴定猪瘟病毒蛋白的方法,为表达猪瘟病毒其他结构蛋白、非结构蛋白奠定了基础。其中,本实验表达的融合蛋白将用于制备对应的抗体,为研究病毒蛋白增殖提供辅助的功能,也为下一步研究猪瘟病毒与宿主细胞的相互作用提供了材料。

论文目录

• 英文缩写词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 实验研究
• 1 实验材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 第二章 文献综述
• 第一节 猪瘟病毒研究进展
• 第二节 猪瘟病毒结构蛋白E0,E2研究进展
• pro,NS4A研究进展'>第三节 猪瘟病毒非结构蛋白N^pro,NS4A研究进展
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢