鲢InDel-RFLP标记开发及其在遗传多样性分析、连锁图谱构建中的应用

论文摘要

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是中国最大的池塘养殖的四大家鱼之一。四大家鱼的养殖可追溯到1000多年前的唐朝,是中国大陆居民最重要的蛋白质来源之一。四大家鱼已经引入到世界20多个国家和地区,用于食用或者控制水质。为加强鲢遗传学研究,已经构建了鲢SSR-AFLP性别平均连锁图谱。为增加连锁图谱的标记密度,并且在一定程度上避开SSR标记开发的高成本和困难性,本研究尝试开发了基于InDel的限制性片段长度多态性标记（InDel-RFLP）并用于鲢图谱构建。微卫星（microsatellite DNA）和碱基插入缺失（insertion-deletion, InDel）是真核生物基因组的常见变异。为避开微卫星标记开发的困难性,本研究基于随机测序的鲢基因组片段,尝试开发基于InDel的限制性片段长度多态性标记（InDel-RFLP）。共133个标记中,65个在一个野生鲢群体中表现多态性（该野生鲢群体采自长江流域荆州段,31个个体）。共检测到161个等位基因,每位点等位基因数从2到4不等,平均值2.5个。六十五个多态性标记中,有35个定位到鲢SSR-AFLP性别平均连锁图谱上。实验还发现:长约2kb的鲢基因组片段比长约1kb的片段更适用于InDel-RFLP标记的开发。设计特异引物,扩增基因组片段,然后用4种限制性内切酶（BsuR I、Hha I、Taq I和Vsp I）之一切成适宜聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的小片段,电泳分离、银染分型。该标记系统避免了对InDel精确定位的困难,通过高分辨PAGE分型,可为鲢连锁图谱构建和性状定位提供丰富的标记位点。1.遗传多样性分析设计的133对InDel-RFLP引物中,65对在鲢野生群体中表现多态性。每位点等位基因数从2到4不等,平均2.5。观测杂合度在0.036-1.000之间变化,期望杂合度在0.070-0.701之间变化。5个位点（ZP02、ZP26、ZP47、P06和P17）显著偏离哈温平衡。ZP26与ZP81之间连锁不平衡。InDel-RFLP标记可用于评价鲢野生群体遗传多样性、描述遗传结构。2.连锁图谱构建开发的133个InDel-RFLP标记中有39个在鲢拟测交作图群体亲本间表现多态性,其中35个标记被添加到鲢性别平均连锁图谱上,4个多态性标记由于不能严格符合作图过程中的各项标准而被舍弃。35个InDel-RFLP标记分布于22个连锁群中。每个连锁群上包含的InDel-RFLP标记数为1-4个。研究发现基于长约2kb片段的InDel-RFLP标记在鲢自交群体中表现多态性的比例、可定位到鲢连锁图谱上的比例以及在鲢野生群体中呈现多态性的比例都远远高于基于1kb片段的InDel-RFLP标记。因此,长约2kb的片段更适合InDel-RFLP标记开发。3.引物跨近缘物种通用性在野生鲢群体表现多态性的65对InDel-RFLP标记引物部分可扩增鳙（55对）、草鱼（22对）和青鱼（30对）DNA,在鳙（45对）、草鱼（10对）和青鱼（14对）中呈现多态性。因鳙、草鱼、青鱼野生群体个体数有限,本研究只对不同鱼相同位点上等位基因数进行了统计。多态位点的等位基因数为:鳙2-4（平均2.267）、草鱼2-5（平均2.300）、青鱼2-4（平均2.286）。从跨物种扩增引物数量、多态性位点数和等位基因数等方面看,鳙是与鲢亲缘关系最近的物种。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. DNA 分子标记概论
• 1.1 遗传标记的定义与发展过程
• 1.1.1 分子标记的定义
• 1.1.2 遗传标记的发展过程
• 1.2 几种常见的分子标记
• 1.2.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 1.2.2 随机扩增多态 DNA（RAPD）
• 1.2.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.2.4 简单序列重复（SSR）
• 1.2.5 碱基插入缺失（InDel）
• 1.2.6 单核苷酸多态性（SNP）
• 1.3 InDel-RFLP 分子标记的定义及其应用
• 1.3.1 InDel-RFLP 分子标记的定义
• 1.3.2 InDel-RFLP 分子标记的目的意义及应用
• 2. DNA 分子标记应用于群体遗传多样性分析
• 2.1 鱼类的遗传多样性
• 2.2 分子标记应用于遗传多样性分析
• 3. 鱼类遗传连锁图谱的构建及应用
• 3.1 连锁图谱构建的基础
• 3.2 连锁图谱构建的方法
• 3.2.1 作图群体
• 3.2.2 作图所使用的分子标记
• 3.2.3 作图软件
• 3.3 鱼类连锁图谱的应用
• 3.3.1 基因的克隆
• 3.3.2 基因定位
• 3.3.3 标记辅助育种（Marker-Assisted Selection， MAS）
• 3.3.4 比较基因组作图
• 4. DNA 分子标记的跨物种使用
• 4.1 青草鲢鳙“四大家鱼”
• 4.2 InDel-RFLP 分子标记在四大家鱼中的应用
• 5. 本论文的研究目的和意义
• 第二章： 鲢InDel-RFLP 标记开发
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 鲢基因组 DNA 的提取
• 1.3 鲢基因组1kb 随机片段、2kb 随机片段文库的构建
• 1.3.1 基因组DNA 的酶切与连接
• 1.3.2 PCR 扩增
• 1.3.3 纯化PCR 产物
• 1.3.4 PCR 产物的凝胶回收
• 1.3.5 连接到质粒载体
• 1.3.6 电转化
• 1.3.7 分别筛选含1kb 目的序列的重组子、含2kb 目的序列的重组子
• 1.3.8 序列测定与分析
• 1.4 引物设计和PCR 扩增
• 2. 结果
• 2.1 鲢基因组DNA 的提取
• 2.2 基因组DNA 的酶切
• 2.3 连接产物进行PCR 扩增
• 2.4 1kb 随机片段、2kb 随机片段：分别由PCR 产物凝胶回收获得
• 3. 讨论
• 3.1 准确回收特定大小的片段
• 3.2 构建2kb 随机片段文库时的严谨性
• 3.3 正确获得目的片段测序序列
• 第三章： 遗传多样性分析
• 1. 材料
• 1.1 样本来源
• 1.3 主要分析软件
• 2 实验方法
• 2.1 野生鲢基因组DNA 的提取及质量检测
• 2.2 InDel-RFLP 引物扩增野生鲢多态性的检验
• 2.2.1 配制PCR 体系
• 2.2.2 初步检测 PCR 产物
• 2.2.3 PAGE 电泳
• 2.3 InDel-RFLP 数据记录和分析
• 3 实验结果
• 3.1 标记的多态性
• 3.2 InDel-RFLP 标记在野生鲢群体中的扩增结果
• 4 讨论
• 4.1 InDel-RFLP 标记可用于评价鲢野生群体遗传多样性、描述遗传结构
• 4.2 InDel-RFLP 标记与SSR 标记在遗传多样性分析方面的比较
• 第四章： InDel-RFLP 标记定位到鲢连锁图谱
• 1. 材料与方法
• 1.1 连锁图谱的作图群体
• 1.2 DNA 提取
• 1.3 主要软件
• 1.4 InDel-RFLP 分析
• 1.4.1 InDel-RFLP 标记选用
• 1.4.2 PCR 扩增
• 1.4.3 PAGE 电泳
• 1.5 连锁图谱构建
• 1.5.1 选择群体分离模式
• 1.5.2 统计分离数据
• 1.5.3 连锁分析
• 2. 结果
• 2.1 InDel-RFLP 标记结果
• 2.2 鲢性别平均连锁图谱的构建
• 3. 讨论
• 3.1 InDel-RFLP 标记应用于连锁图谱构建的效果
• 3.2 InDel-RFLP 标记、SSR 标记、AFLP 标记的综合应用
• 第五章： 跨物种通用性分析
• 1. 鲢InDel-RFLP 引物跨物种应用于鳙鱼、草鱼、青鱼
• 1.1 鳙鱼、草鱼、青鱼自然群体的构建
• 1.2 DNA 提取
• 1.3 InDel-RFLP 在鳙、草鱼、青鱼的跨物种通用分析
• 1.3.1 PCR 体系的配制与PCR 扩增
• 1.3.2 PCR 产物的酶切
• 1.3.3 PCR 酶切产物进行PAGE 电泳
• 1.3.4 InDel-RFLP 数据统计及分析
• 2. 结果
• 2.1 InDel-RFLP 标记的跨物种可用性
• 2.2 InDel-RFLP 标记在鳙、草鱼、青鱼里的具体扩增表现
• 3. 讨论
• 3.1 InDel-RFLP 标记在鳙、草鱼、青鱼自然群体里的通用程度
• 3.2 鲢与鳙、草鱼、青鱼的亲缘关系的远近
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
• 附录