UHS-蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体转染小鼠成纤维细胞的研究

论文摘要

为了加速建立利用转基因技术的通过动物被毛获取蜘蛛丝蛋白的新方法,本研究以小鼠为模型,在利用常规法建立小鼠成纤维细胞系的基础上,依次通过小鼠皮肤特异性启动子的克隆、连接蜘蛛丝蛋白基因的表达载体的构建、转染小鼠成纤维细胞等程序,探讨了建立转蜘蛛蛋白基因二聚体阳性细胞的可能性。其结果:（1）采用常规方法,利用新鲜或冷藏保存96h以内的胎鼠皮肤经原代和传代培养后建立了小鼠成纤维细胞系。（2）对GenBank中的蜘蛛拖丝蛋白基因序列人工合成的丝蛋白基因单体,利用不同的酶切位点进行了二聚化,通过用BglII、NcoI及BamHI、NcoI分别双酶切构建了蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体的质粒;（3）成功克隆了在小鼠皮肤中特异表达的超高硫角蛋白（UHS）启动子。将其与pAcGFP1-N1载体以及pβgal-Basic载体连接,分别构建了UHS-GFP和UHS-β-gal表达载体;所构建的UHS-GFP具有体外培养的小鼠成纤维细胞的活性,而UHS-β-gal表达载体具有在胎鼠皮肤块组织中的表达活性。（4）通过BglII和BamHI双酶切得到小于5000bp和1000～2000bp的条带,PCR鉴定得到约700bp的UHS条带,以此验证成功构建UHS-2S-3.1表达载体。（5）对转染后的成纤维细胞进行G418抗性筛选扩增的阳性细胞,经对其基因组DNA的PCR鉴定,确认基因组整合有目的基因（蜘蛛丝蛋白基因二聚体）。上述结果为进一步开展转蜘蛛丝蛋白基因的阳性细胞筛选并建立细胞系,为通过体细胞核移植技术获得转基因小鼠及建立利用动物被毛获得蜘蛛丝的新方法奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 蜘蛛拖丝蛋白
• 1.1.1 蜘蛛和蜘蛛丝
• 1.1.2 蜘蛛丝蛋白的研制
• 1.1.3 蜘蛛丝的潜在应用价值
• 1.2 动物转基因
• 1.2.1 动物转基因研究
• 1.2.2 体细胞核移植
• 1.3 成纤维细胞的应用
• 1.4 启动子及报告基因
• 1.4.1 启动子的相关研究
• 1.4.2 报告基因
• 1.5 研究目的及意义
• 2 小鼠成纤维细胞系的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验药品
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胎鼠皮肤的获得及保存
• 2.2.2 成纤维细胞的原代培养
• 2.2.3 成纤维细胞的传代培养
• 2.2.4 原代培养细胞的冷冻-复苏及传代培养
• 2.2.5 观察与数据统计
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 4℃条件下保存时间及方法对原代培养成纤维细胞贴壁及汇合的影响
• 2.3.2 4℃条件下保存时间及方法对传代培养成纤维细胞贴壁及汇合的影响
• 2.3.3 4℃条件下保存时间对原代培养成纤维细胞冷冻-复苏后贴壁及汇合的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 蜘蛛拖丝蛋白基因的合成及二聚化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌种及质粒
• 3.1.2 主要试剂配制
• 3.1.3 主要药品的配制
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 人工合成的拖丝蛋白基因单体
• 3.2.2 拖丝蛋白基因的二聚化
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 小鼠超高硫角蛋白启动子的克隆及载体构建
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物及菌种
• 4.1.2 载体信息
• 4.1.3 实验主要试剂
• 4.1.4 主要药品的配制
• 4.1.5 只要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 小鼠超高硫角蛋白（UHS）启动子的克隆及序列分析
• 4.2.2 小鼠超高硫角蛋白（UHS）启动子表达载体的构建
• 4.2.3 UHS-GFP的活性检测
• 4.2.4 UHS-β-gal的活性检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 小鼠超高硫角蛋白（UHS）启动子的克隆
• 4.3.2 小鼠超高硫角蛋白（UHS）启动子表达载体的构建
• 4.3.3 小鼠超高硫角蛋白（UHS）启动子的活性检测
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 真和表达载体的构建及转染小鼠成纤维细胞
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验动物及菌种
• 5.1.2 载体信息
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 UHS-2S-3.1表达载体的构建
• 5.2.2 细胞转染
• 5.2.3 转染细胞的筛选
• 5.2.4 转染细胞的基因组PCR鉴定
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 UHS-2S-3.1表达载体的构建与鉴定
• 5.3.2 转染细胞的PCR基因组鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢