人类基因hUBC16和GPx7的克隆与功能研究

论文摘要

本实验室大规模的cDNA克隆与测序工作积累了大量的全长基因库。借助大量的生物信息学手段，我们试图从这些库中去筛选可能与重要的生理途径及人类疾病密切相关的基因进行研究。在此基础上我们筛选到了两条感兴趣的基因分别进行研究，它们是hUBC16和GPx7。hUBC16的cDNA全长2252bp，编码一个162个氨基酸的蛋白质。蛋白序列分析显示hUBC16具有一个重要的功能结构域：泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC）结构域。且信息学分析推测hUBC16与拟南芥（Arabidopsis thaliana）UBC16高度同源，可能为人类泛素结合酶蛋白家族的新成员。泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme）又简称为E2，是泛素系统的主要部件之一，作为一个中间桥梁般的角色，它从泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，或简称E1）接受泛素，和泛素形成了高能硫脂键，再把泛素交给下游的部件：泛素连接酶（ubiquitin ligase，或简称E3）或直接底物，底物被泛素修饰后，将被降解，或生命活动受到调节。经生物信息学预测发现hUBC16可能定位于细胞核中，用NCBI数据库中进行blastn，blastp等生物信息学分析发现hUBC16的蛋白C端具有两个核定位信号，在102位的半胱氨酸可能是它的酶活中心，并且用体内体外实验验证了酶活中心的确是102位的Cys；亚细胞定位实验表明hUBC16主要定位于细胞核中与生物信息学预测的结果一致，我们也用实验证实了活性中心对于hUBC16的正确定位发挥着与核定位信号同等重要的作用；酵母双杂交实验筛选出一些潜在的可能与hUBC16相互作用的蛋白：ERAL1；UBE1v2；RNF167；KIAA1972；RNF8。细胞周期实验检测发现，hUBC16的上调表达会促使处于细胞周期S期的细胞比例增加，而下调hUBC16的表达会导致处于细胞周期S期的细胞比例减少，表明hUBC16对细胞增殖具有促进作用，但其促进细胞周期的分子机理仍然还不清楚，有待进一步实验的深入研究。谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）可以保护细胞免受由呼吸代谢产生的活性氧自由基的氧化伤害，也具有与细胞周期、细胞信号转导调控相关的功能，我们克隆到一个人cDNA序列，经生物信息学分析发现其编码一个长187个氨基酸的蛋白具有GSHPx的结构域和BtuE的基序，并且通过基因和编码蛋白的结构信息分析表明它就是NPGPx基因。通过生物信息学EST分析，以及组织表达谱分析，证实它在正常组织中广谱表达，具有肿瘤组织表达特异性。我们克隆了全长GPx7的cDNA，亚细胞定位预测与亚细胞定位实验表明GPx7主要定位于细胞质中。酵母双杂交实验筛选出一些潜在的可能与GPx7相互作用的蛋白：RAN and EIF3S12。序列分析发现RAN是原癌基因Ras超家族中的成员，对细胞增殖起到促进作用，而EIF3S12目前仅知道它是真核转录促进因子3的一个亚基，可能参与真核基因的转录。细胞周期实验证明GPx7的上调表达会使细胞周期G1期细胞所占比例增加，同时S期细胞所占比例急剧减少，此外同时上调GPx7与RAN的结果发现比单独上调表达RAN而引起的S期细胞增加比例要小，上述结果看出GPx7可能对细胞周期进程具有抑制作用。综合而言，我们克隆了一条新的人类泛素结合酶基因hUBC16和一条已报道的谷胱甘肽过氧化物酶基因GPx7并对它们的功能进行了研究。结果显示hUBC16与GPx7都与细胞周期有关，hUBC16可能对细胞增殖起到促进作用，而GPx7的上调可能对细胞周期进程起到抑制作用，但具体的分子机理还不明确。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 第一部分 人泛素结合酶基因hUBC16的克隆与功能研究
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 1.材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 菌株、质粒和细胞株
• 1.3 试剂盒与常用酶类
• 1.4 抗体与常用试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 常用试剂配制
• 1.7 计算机软件及数据库
• 1.8 引物
• 2.方法
• 2.1 cDNA文库的构建、测序以及生物信息学初步分析
• 2.2 MTC Panel表达谱分析
• 2.3 GST-hUBC16融合蛋白的表达和纯化
• 2.4 GST-hUBC16蛋白体外与泛素的结合实验
• 2.5 真核细胞的培养和转染
• 2.6 亚细胞定位
• 2.7 Western Blot检测GFP-hUBC16体内与泛素的结合
• 2.8 酵母双杂交系统筛选与hUBC16相互作用的蛋白
• 2.9 hUBC16对细胞周期影响的初步检测
• 2.10 hUBC16对细胞凋亡影响的初步检测
• 第三章 实验结果
• 1.hUBC16基因的克隆和信息学分析
• 1.1 hUBC16基因的克隆和核酸序列分析
• 1.2 hUBC16基因的染色体定位和基因结构
• 1.3 hUBC16的保守结构域分析和活性中心预测
• 1.4 hUBC16的蛋白同源性分析
• 1.5 hUBC16的亚细胞定位和核定位信号预测
• 1.6 翻译后泛素化修饰
• 2.hUBC16基因的表达谱分析
• 2.1 电子表达谱
• 2.2 RT-PCR检测表达谱
• 3.hUBC16原核表达和体外泛素结合实验
• 3.1 GST融合蛋白的原核表达
• 3.2 体外泛素化修饰
• 4.hUBC16的亚细胞定位与体内泛素结合实验
• 4.1 hUBC16的亚细胞定位
• 4.2 体内泛素化修饰
• 5.酵母双杂交筛选可能与hUBC16相互作用的蛋白
• 5.1 阳性菌落的初选和PCR筛选
• 5.2 测序结果分析
• 6.hUBC16对细胞周期影响的初步检测
• 6.1 hUBC16上调表达对细胞周期影响的初步测定
• 6.2 hUBC16下调表达对细胞周期影响的初步测定
• 7.hUBC16对细胞调亡影响的初步检测
• 第四章 讨论
• 1.hUBC16基因编码蛋白的保守结构域
• 2.hUBC16活性中心预测以及初步验证
• 3.hUBC16可能的亚细胞定位机制
• 4.hUBC16可能参与核内蛋白功能的调控
• 5.hUBC16可能对细胞周期的影响
• 小结
• 第五章 综述:泛素结合酶研究进展
• 1.泛素结合酶与多泛素化修饰
• 1.1 多泛素化修饰又称泛素—蛋白酶途径
• 1.2 泛素-蛋白酶体降解蛋白的作用机制
• 1.3 泛素-蛋白酶体途径与p53
• 1.4 泛素-蛋白酶体途径与p27、cyclin
• 2.泛素结合酶与单泛素化修饰
• 2.1 单泛素化修饰参与的生理功能
• 2.2 单泛素化修饰也是泛素结合酶进行自身调节的一种机制
• 3.泛素结合酶（E2）与泛素连接酶（E3）的相互作用机制
• 4.泛素化修饰是一种信号
• 5.泛素化修饰在肿瘤耐药性研究方面的应用
• 参考文献
• 第二部分 人谷胱甘肽过氧化物酶基因GPx7的克隆与功能研究
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 1.材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 菌株、质粒和细胞株
• 1.3 试剂盒和常用酶类
• 1.4 抗体和常用试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 常用试剂配制
• 1.7 计算机软件及数据库
• 1.8 引物
• 2.方法
• 2.1 cDNA文库的构建、测序以及生物信息学初步分析
• 2.2 MTC Panel表达谱分析
• 2.3 GPx7的原核诱导表达
• 2.4 真核细胞的培养和转染
• 2.5 亚细胞定位
• 2.6 酵母双杂交系统筛选与GPx7相互作用的蛋白
• 2.7 细胞周期及凋亡检测
• 第三章 实验结果
• 1.GPx7基因的克隆和信息学分析
• 1.1 GPx7基因的克隆和核酸序列分析
• 1.2 GPx7的保守结构域分析
• 1.3 GPx7基因的染色体定位和基因结构
• 1.4 GPx7的蛋白同源性分析
• 1.5 GPx家族蛋白进化树分析
• 1.6 亚细胞定位预测
• 2.GPx7基因的表达谱分析
• 2.1 EST分析
• 2.2 RT-PCR检测表达谱
• 3.GPx7原核表达
• 3.1 His-GPx7融合蛋白的原核表达
• 3.2 GST-GPx7融合蛋白的原核表达
• 4.GPx7的亚细胞定位
• 5.酵母双杂交筛选可能与GPx7相互作用的蛋自
• 5.1 阳性菌落初筛
• 5.2 PCR检测阳性克隆
• 5.3 测序结果的分析
• 6.GPx7对细胞周期影响的初步检测
• 7.GPx7对细胞调亡影响的初步检测
• 第四章 讨论
• 小结
• 第五章 综述:谷胱甘肽过氧化物酶研究进展
• 1.谷胱甘肽过氧化物酶的反应机制
• 2.谷胱甘肽过氧化物酶对信号通路的影响
• 3.谷胱甘肽过氧化物酶对细胞周期的影响
• 4.谷胱甘肽过氧化物酶对细胞调亡的影响
• 5.谷胱甘肽过氧化物酶的生理功能
• 5.1 谷胱甘肽过氧化物酶对线粒体的保护
• 5.2 谷胱甘肽过氧化物酶对大脑膜系统的保护
• 6.谷胱甘肽过氧化物酶与人类疾病
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢